2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Среди лабораторных животных могут быть распространены латентные ин-

фекции (характеризуются тем, что возбудитель постоянно находится в организме,

но не проявляет себя клинически). При снижении резистентности организма, воз-

будитель бурно размножается и вызывает клинику болезни. Из латентных инфек-

ций лабораторных животных вирусной этиологии значительное распространение имеет эктромелия белых мышей, вирусные пневмонии, нейроинфекции.

Метод контроля животных на носительство возбудителей латентных инфек-

ций: готовят суспензии из отдельных органов животных, специально убитых для этой цели, и вводят их соответствующими методами животным того же хозяйства

(например, суспензию из мозга вводят интрацеребрально). При наличии латент-

ной инфекции проведенный таким образом пассаж вируса приведет к острому те-

чению болезни.

Уход за животными и их содержание. Придерживаются двух правил:

1. Необходимо обеспечить функционирование всех систем организма в пре-

делах физиологической нормы.

2. Исключить взаимное перезаражение и распространение инфекции за пре-

делы вивария.

Животных содержат в виварии с учетом норм зоогигиены. Животных обеспе-

чивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Уборку помещения и кормление начинают со здоровых. Для ухода за зараженны-

ми животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфици-

руют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезвеществ. По окон-

чании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

Техника безопасности при работе с лабораторными животными. Источни-

ком инфицирования людей могут служить экспериментально зараженные живот-

ные и их эктопаразиты. Профилактика заражения людей от животных проводится с учетом пути передачи возбудителя. Контроль за состоянием здоровья сотрудни-

31

ков лаборатории ведет медицинская служба. При работе в лаборатории с вируса-

ми бешенства, клещевого энцефалита, инфекционного гепатита и некоторыми другими инфекциями сотрудникам делают прививки против этих болезней.

Метка лабораторных животных. Бирка с надписью (использованный для заражения вирус или номер экспертизы исследуемого патматериала, количество зараженных животных, дату заражения и, если надо, другие сведения).

Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампо-

ванным номером. Бирки надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу - окольцовывают

(курам).

При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при не-

продолжительном сроке можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах (у

кроликов). Морских свинок можно различать по окраске, которую регистрируют в рабочем журнале.

Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдель-

ных пальцев на передних или задних конечностях, каждый из которых соответст-

вует тому или другому порядковому номеру: на передних лапах - единицам, на задних - десяткам. Однако чаще пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей (растворов фуксина, бриллиантовой зелени) удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставятся в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если тело животного мыс-

ленно разделить на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то на-

несение цветных пятен начинают с левого верхнего угла, т. е. лопатки, и это будет соответствовать 1. Тогда, двигаясь назад, левый бок соответствует 2, а левое бед-

ро - 3, далее затылок - 4, спина - 5, область репицы - 6, правое плечо - 7, правый бок - 8, правое бедро - 9. Используя два цвета красителей, можно дать обозначе-

ния одним из них - единиц, другим - десятков.

32

Методы экспериментального заражения лабораторных животных (рисунок

1). Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса (способность реп-

родуцироваться в определен-

ных типах клеток организ-

ма). Вирусы, репродуцирую-

щиеся в нервных клетках, на-

зываются нейротропными

(вирус бешенства), репроду-

цирующиеся в клетках кожи

- дермотропными (вирус ос-

пы), в клетках легких - пнев-

мотропными (вирус гриппа). Рисунок 1 - Фиксация крыс корнцангом.

Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются

политропными (вирус ИРТ КРС в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток - пантропными (вирус чумы собак). Зная тропизм вируса, ма-

териал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. При отсутствии данных о тропизме вируса, заражение проводят разными методами.

Рисунок 2 - Фиксация мышей (а), введение материала (б).

Объем заражающей дозы материала варьирует в зависимости от метода вне-

сения и вида животных.

Способы фиксации у разных животных свои. Кроликов удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой рукой придерживают заднюю часть тела. Такая фиксация предотвращает получение царапин. Морских свинок держат одной ру-

33

кой за грудь, а другой - за задние лапы. Крыс и мышей берут за хвост, дают им возможность уцепиться передними конечностями за металлическую сетку (клет-

ки), захватывают двумя пальцами левой руки кожу на затылке и слегка растяги-

вают животное. При этом крыс прочнее и безопаснее фиксировать корнцангами

(рисунок 1), а для большей надежности голову животного можно удерживать двумя корнцангами за щечные кожные складки. Оба этих корнцанга помощник держит в левой руке, а корнцанг, фиксирующий хвост, - в правой. Белых мышей без помощника фиксируют, захватывая складку кожи между ушами пинцетом Пеано, который, в свою очередь, укрепляют на стоящую в обычном штативе про-

бирку. Возможна фиксация мышей и одной рукой (рисунок 2).

Перед заражением место введения материала тщательно обрабатывают 3 %

спиртовым раствором йода.

Методы заражения лабора-

торных животных:

Подкожный метод - кожную складку, захваченную большим и указательным пальцами левой ру-

ки, приподнимают и в ее основа-

ние параллельно поверхности те-

Рисунок 3 - Подкожное заражение.

ла вводят иглу со шприцем. Местом инъ-

екции у большинства животных область спины, бока, плеча, лопатки и реже боко-

вой стенки грудной клетки (собака), ко-

ленной складки (морская свинка), шеи

(куры) (рисунок 3).

Внутрикожный метод - у кроликов

на боку или животе выстригают, а за- Рисунок 4 - Внутрикожное заражение.

тем выбривают шерсть на участке кожи. Подготовленное поле протирают спир-

том и физраствором. Иглу шприца скосом наружу вводят под острым углом в

34

толщу поверхностного слоя кожи на несколько мм. Материал инъецируют до приподнимания слоя кожи в виде бугорка. Мелким животным в/к вводят матери-

ал в плантарную поверхность задней конечности, которую фиксируют, отводя ее назад и помещая на указательный палец левой руки. Правой рукой иглу со шпри-

цем вводят в кожу в направлении от пальцев к голеностопному суставу (рисунок

4).

Для размножения в организме дермотропных вирусов материал втирают в скарифицированную кожу. На коже, подготовленной, как и для внутрикожного заражения, делают несколько поверхностных царапин иглой или обломленной пастеровской пипеткой до появления капелек лимфы. Затем наносят материал и втирают его шпателем, стеклянной палочкой или остриженной зубной щеткой.

Заражение в скарифицированную кожу у крупных животных проводят на боку или животе, у морской свинки - на плантарной поверхности ступни, у мелких жи-

вотных - в области спины, у петухов - в гребень и сережки, а также в перьевые

фолликулы голени сразу же после удаления перьев.

Внутримышечный метод - выбирают мышцы бедра, а у кур - большую мышцу груди. Иглу после дезинфекции места инъекции вводят через кожу и под-

кожную клетчатку в мышцы, направляя перпендикулярно к поверхности тела.

После инъекции материала иглу извлекают, место введения повторно дезинфици-

верхушкой грудной кости и клоаки короткую иглу вводят сквозь кожу и брюшин-

ную складку, направляя под углом 45 ° к продольной оси тела. При этом левой

35

рукой слегка оттягивают лапу животного, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по ис-

чезнувшему сопротивлению брюшной стенки. Мышам в/б можно вводить 0,2-8,0

мл раствора (рисунок 5).

Внутривенный метод - важно контролировать, чтобы в вену из шприца не попали пузырьки воздуха или частицы материала,

которые могут вызвать эмболию и гибель жи-

вотного. Белых мышей и крыс заражают в боковые вены хвоста, предвари-

тельно расширив их, рас-

ным ксилолом или горячей водой. Помощник левой рукой сдавливает хвост у корня, а правой фиксирует животное за кожу затылка. Иглу скосом наружу вводят под острым углом в вену нижней трети хвоста, где кожа тоньше, и направляют к корню хвоста. Если игла попала в сосуд, го жидкость легко поступает из шприца,

а сосуд на всем протяжении бледнеет. Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал. Затем вену передавливают ниже места вкола, иглу извлекают, и

место инъекции прижимают сухой ватой. Если вводимый раствор проталкивается с трудом, хвост набухает, то жидкость из шприца попала под кожу, а не в вену.

Морским свинкам можно ввести вирус в ток крови, только проникнув иглой в сердце. Для этого определяют место сердечного толчка, в межреберный промежу-

ток слева и на 1 см выше мечевидного отростка вводят иглу без шприца. Если в игле покажется кровь, значит, игла попала в сердце, и тогда, присоединив шприц,

инъецируют материал. Кроликам в/в материал вводят в краевую вену уха, предва-

рительно удалив волосы на месте инъекции и пережав сосуд ниже вкола иглы.

Игла должна быть направлена по ходу тока крови, т.е. к голове (рисунок 6). Птице вируссодержащий материал вводят в подкрыльцовую вену.

36

Интраназальный метод - большинство лабораторных животных (за исклю-

чением кроликов) при закапывании материала в ноздри чихают и разбрызгивают вируссодержащую суспензию. Поэтому перед и/н заражением животным делают глубокий эфирный наркоз (помещают в банку с крышкой и кусочком смоченной эфиром ваты). Заснувших животных извлекают, фиксируют вверх ноздрями. Ма-

териал по каплям вводят в ноздри, и с вдыхаемым воздухом он втягивается внутрь. Кроликам вируссодержащую суспензию закапывают в ноздри по каплям при запрокинутой на спину голове без наркоза.

Интрацеребральный метод - кожу головы мышат большим и указательным пальцами левой руки оттягивают к затылку. Иглой шприца с ограничителем про-

калывают кожу и череп на глубину 1-2 мм в точке, лежащей в центре квадрата,

образованного средней сагиттальной линией и перпендикуляром к ней, походя-

щим по наружному краю глазниц. Белых крыс и/ц заражают через трепанацион-

ное отверстие, а молодых кроликов и морских свинок - прокалывая кости черепа в надглазничной борозде, где кость довольно тонкая. Иглу используют с ограни-

чителем, обеспечивающим проникновение иглы не более чем на 4-5 мм. Старых животных и/ц заражают через трепанационное отверстие.

После заражения животных помещают в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы исследуемого материала, ко-

личества и номеров зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают название вируса или номер экспертизы исследуемого материала, ко-

личество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод (веде-

ния и дозу вируса).

За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внеш-

ний вид, подвижность, прием пищи и т. п. Следует отметить, что гибель живот-

ных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсиче-

ским действием исследуемого материала.

Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного. В

последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными,

контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса чувстви-

37

тельные к нему клетки повреждаются или гибнут (при значительном поврежде-

нии вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа).

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального за-

ражения считают косвенным доказательством размножения вируса. Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопро-

бы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале со-

держался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер

(угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал за-

болевание.

Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через опреде-

ленное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме.

На размножение вируса в организме указывают не только клинические при-

знаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, ко-

торые возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанато-

мические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистен-

ции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Итак, три признака указывают на наличие вируса в материале, которым за-

ражали лабораторных животных: - симптомы болезни, - патологоанатомические изменения и - гибель. Однако не всегда названные признаки сопровождают раз-

множение вируса в организме. Например, вирус, содержащийся в патматериале,

полученном от лошади, не может легко и с клиническими проявлениями размно-

жаться в организме белых мышей. В первом пассаже лишь единичные вирусные частицы найдут для себя чувствительные клетки, но их будет так мало относи-

тельно целого органа, что видимых изменений организма не возникнет. Такой пассаж получил название «слепого».

Вскрытие лабораторных животных (рисунок 7). Для изучения патологоана-

томических изменений и получения вируссодержащего материала, эксперимен-

38

тально зараженных животных вскрывают сразу после гибели, что предотвращает обсеменение органов и тканей микрофлорой, находящейся при жизни животного на поверхности слизистых оболочек, особенно в кишечнике. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального проявления симпто-

мов болезни или при их отсутствии на 8-10 день после заражения.

Убить животное можно избыточной дозой наркоза, а также (мелких живот-

ных) путем разрыва спинного мозга.

Для удобства вскрытия труп животного фиксируют. Более крупных живот-

ных укрепляют на специальных вскрывочных стоянках или на доске с приспособ-

лением для фиксации ко-

нечностей и головы. Мел-

ких животных целесообраз-

но фиксировать в кювете с залитым воском (парафи-

ном) и покрытым бумажной салфеткой дном. Для фик-

сации используют инъекци-

онные иглы или одно-

стержневые булавки (портновские). Вскрытие выполняют стерильными инстру-

ментами.

Брюшную и грудную полости вскрывают при фиксации животного в спин-

ном положении с направленными в стороны и укрепленными передними и задни-

ми конечностями. Шерсть животного по линии разреза обрабатывают дезраство-

ром. Мелких животных перед вскрытием можно опускать полностью в дезрас-

твор, держа за хвост. Разрез кожи делают по белой линии от лонной кости (сим-

физа) до шеи. Чтобы при этом не прорезать брюшную стенку, пинцетом, нахо-

дящимся в левой руке, приподнимают кожу и делают сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза, а затем, вставив одну браншу ножниц в образовавшееся отверстие, разрезают кожу до шеи животного, после чего кожу разрезают по направлению к каждой из четырех конечностей. Тупым

39

путем кожу отпрепаровывают, открывая ее лоскуты вправо и влево наподобие дверок шкафа. Лоскуты кожи фиксируют булавками за верхние и нижние углы.

Заменив инструменты, вскрывают брюшную полость. Для этого разрез брюшной стенки делают под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кос-

ти. Треугольники брюшной стенки отводят в стороны и фиксируют. В качестве вируссодержащего материала из брюшной полости берут кусочки (или целый ор-

ган у мелких животных) печени, селезенки, почки, брыжеечные лимфатические узлы, участок кишечника при наличии патологоанатомических изменений или симптомов болезни, наблюдавшихся перед смертью.

Грудную полость вскрывают с учетом того, что она имеет твердые стенки.

Для получения доступа к находящимся в ней органам с нее надо как бы снять

«крышку». Для этого разрезают ребра поперек сзади вперед, удаляя их вместе с грудной костью.

Череп вскрывают, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы. Кожу головы и шеи обрабатывают дезраствором.

Разрез кожи делают перпендикулярно оси тела за ушами, продолжают слева и справа вперед к глазницам. Кожу вместе с ушами отпрепаровывают и отбрасыва-

ют вперед, оголяя черепную коробку. Одну браншу ножниц вставляют в большое черепное отверстие и режут кости черепа имени и вправо по направлению к глаз-

ницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют весь вырезан-

ный участок. Если кости черепа толстые, их распиливают по тем же направле-

ниям. Можно разрезы черепа вести от глазниц назад.

Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекают из основания черепа, подняв его слегка раздвинутыми браншами ножниц и подрезав черепно-мозговые нервы.

Основное требование к вируссодержащему материалу - максимальное со-

держание в нем вируса, что определяется тропизмом вируса. Поэтому, вскрывая животное, обращают внимание на то, какие органы имеют патологические изме-

нения, т.е. предположительно содержат вирус. Измененные органы берут в каче-

40