2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)
.pdfРисунок 43 - Принцип ПЦР.
комплементарное связывание праймера с ДНК-матрицей (отжиг);
синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы (достройка праймера) и состав-
ляют суть каждого цикла ПЦР.
Далее этот стандартный цикл ПЦР - плавление, отжиг, синтез - воспроизво-
дится многократно, и в идеале количество амплификонов растет в геометрической прогрессии.
Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК амплификонов в количестве, достаточном для дальнейшего исследо-
вания или индикации. Индикация может быть произведена электрофорезом с ок-
рашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно ме-
ченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуоромет-
рическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР ме-
ченых предшественников синтеза НК.
131
Основными компонентами ПЦР являются:
фермент Taq-ДНК-полимераза;
пара олигонуклеотидных праймеров;
четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов.
Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минераль-
ное масло. |
|
ДНК-полимеразы выдержи- |
|
вают многократный нагрев до 90 |
|
°С, что позволяет проводить реак- |
|
ции в - амплификаторе (amplifica- |
|
tion - англ. умножение, усиление) - |
|
приборе, обеспечивающем под- |
|
держку в реакционной смеси за- |
|
данной температуры в течение за- |
|
данного времени (рисунок 44). Taq- |
|
ДНК-полимераза синтезирует цепь |
|
ДНК до 1000 пар оснований в 1 |
|
мин. Кроме того, возможности |
Рисунок 44 - Амплификатор. |
|
ПЦР в идентификации ДНК- и РНК-содержащих вирусов еще больше возросли с выделением новой полимеразы (из термофильного микроорганизма Thermus thermophilus), обладающей как полимеразной, так и обратнотранскриптазной ак-
тивностью. С помощью этого фермента упрощается выявление РНК-содержащих вирусов в ПЦР.
Праймеры для ПЦР имеют длину 20-30 нуклеотидов, должны быть компле-
ментарны выбранному месту в матрице. Особенно жесткие требования предъяв-
ляются к комплементарности 3'-концевой части праймера, в то время как в сред-
ней и 5'-концевой его части допустимы нуклеотидные замены. Чем больше нук-
леотидов в праймере, тем специфичнее ЦПР; короткие праймеры часто «ошиба-
ются».
132
Дезоксинуклеозидтрифосфаты: дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ в реакцион-
ной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.
Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы.
Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента.
Наиболее распространен трис-НС1-буфер (рН6,8-7,8), содержит желатин или бы-
чий сывороточный альбумин и неионные детергенты для стабилизации фермента.
Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси для
предотвращения испарения в процессе ПЦР.
Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов: из исследуемого ма-
териала выделяется ДНК-матрица; в пробирке смешивают ДНК, праймеры, де-
зоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу. На первом этапе
пробирка с инкубационной смесью нагревается до температуры дена-
турации ДНК (90-100 °С), при этом две цепи ДНК расходятся. Затем проба инкубируется при темпера-
туре гибридизации праймеров |
с |
||
ДНК-матрицей (55-65 °С) и на |
|
||
последнем |
этапе |
ДНК- |
Рисунок 45Учет результатов ПЦР. |
полимераза |
осуществляет |
ком- |
|
плементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью дезоксирибонуклео-
зидтрифосфатов (72 °С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. В следующем цикле синтез осуществляется с
4 копий, далее с 8 и т. д. до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови. Индикацию амплифицированного генетического материала проводят одним из вышеуказан-
ных методов (рисунок 45).
Любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК,
133
выбранному для амплификации. Праймеры ориентированы так, что синтез с по-
мощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий заданного участка ДНК. Оптимальное расстояние между праймерами (длина ам-
плифицируемого участка) составляет 200-500 пар нуклеотидов. Практически уда-
ется амплифицировать фрагменты ДНК длиной до 3-4 тыс., хотя можно достичь и
10 тыс. пар нуклеотидов. Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно получить амплификацию заданного участка ДНК в миллион раз. В то же время длинные неограниченные копии ДНК могут синтезироваться только с исходных, «родительских» цепей ДНК, и за 20 циклов ПЦР может образоваться лишь 20 та-
ких копий каждой из «родительских» цепей, это очень мало по сравнению с коли-
чеством основного продукта.
Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе
(20-25 циклов), после чего начинается выход на плато (после 40-45 циклов) в силу истощений дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и нарастающего темпера-
турного повреждения Taq-ДНК-полимеразы, конкуренции за фермент амплифико-
нов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-ДНК-полимеразы.
В качестве исходной матрицы для ПЦР может быть использована ДНК, вы-
деленная как из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных, вы-
сушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично деградированные нуклеиновые кислоты, т.е. объекты, ранее недоступные для анализа. Так, с помо-
щью ПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК египетской мумии, продемонстрирована возможность анализа специфических участков ДНК при наличии одного волоса, клетки, сперматозоида в целях идентификации лич-
ности и пола хозяина.
Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяе-
мыми НК. Для исключения ложноположительного результата необходимо обяза-
тельное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, предварительной ультрафиолетовой обработки поме-
щения и рабочих поверхностей столов и приборов.
134
Можно не только амплифицировать нужную ДНК, но и вносить в нее необхо-
димые изменения. Эта возможность обусловлена тем, что, с одной стороны, прай-
меры физически входят в состав ДНК-продукта, а с другой — последовательность праймера, особенно вблизи его 5'-конца, может отличаться от последовательности ДНК-мишени. Праймер, содержащий на 5'-конце некомплементарный довесок длиной до 45 нуклеотидов, эффективно работает в ПЦР.
ПЦР удобна для изучения и диагностики наследственных и вирусных забо-
леваний, когда серологические тесты или культивирование вируса затруднены или малоэффективны, когда вирус имеет высокую антигенную изменчивость, что осложняет применение иммунологических методов диагностики.
Достоинства ПЦР:
быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при па-
раллельной обработке 10-12 образцов;
надежность анализа. Под этим подразумевается защищенность от ложно-
положительных и ложноотрицательных результатов. При аккуратной работе с об-
разцами и реактивами, при использовании всех контролей, надежного оборудова-
ния и жестко стандартизированных реактивов методы диагностик вирусных ин-
фекций, основанные на ПЦР, являются высоконадежными;
чувствительность анализа - наименьшая концентрация клеток или вирус-
ных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется сочетанием следующих 3-х факторов: эффективного выделения НК возбудителя,
чувствительности собственно ПЦР и чувствительности выбранного метода инди-
кации. ПЦР позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от не-
скольких копий до одного возбудителя в пробе;
специфичность анализа 100 % - выявление возбудителей конкретного ви-
да, рода на фоне других вирусов и клеток организма-хозяина.
пригоден любой материал, гистологические препараты;
количество исследуемого материала составляет несколько десятков мик-
ролитров;
метод позволяет определить число копий возбудителя в пробе и тем са-
135
мым контролировать вирусемию или бактериемию в процессе лечения;
исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или тер-
мической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возмож-
ность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР;
простота исполнения и возможность полной автоматизации.
ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не произ-
водящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР.
Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших размерах. Необходимо неуклонно выполнять специальные требования к плани-
ровке и режиму работы ПЦР генодиагностической лаборатории.
Эта реакция успешно используется при диагностике вирусной диареи, чумы,
ИРТ КРС, ящура, чумы свиней, болезни Ауески, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц и др.
Перечень контрольных вопросов:
1.Принцип ПЦР.
2.Амплификация,
3.Праймеры.
4.Денатурация.
5.Отжиг.
6.Элонгация.
7.Постановка ПЦР.
8.Учет результатов ПЦР.
9.Задачи, которые можно решить с помощью ПЦР.
10.Достоинства и недостатки ПЦР.
Тема 1.14. Коллоквиум № 2 по серологическим реакциям
Цель: проверить остаточные знания студентов по пройденному материалу
Содержание:
реакция нейтрализации;
136
реакция диффузной преципитации;
реакция иммунной диффузии;
реакция торможения гемагглютинации;
реакция непрямой гемагглютинации;
метод флуоресцирующих антител;
иммуноферментный анализ;
метод ДНК-зондов;
полимеразная цепная реакция.
РАЗДЕЛ 2. ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
Тема 2.1. Лабораторная диагностика бешенства
Цель: изучить лабораторные методы диагностики бешенства и биологические особенности возбудителя.
Содержание:
отправка патологического материала в лабораторию;
схема лабораторной диагностики вируса;
РИФ;
ИФА;
ПЦР;
РДП;
выделение вируса in vitro на культурах клеток;
выявление телец Бабеша-Негри;
постановка биологической пробы;
методы прижизненной диагностики бешенства;
дифференциация бешенства от других заболеваний;
некоторые сведения о вирусе бешенства.
137
Отправка патологического материала в ветеринарную лабораторию
В лабораторию нарочным от мелких животных направляют свежие трупы мелких животных целиком предва-
рительно обработанные инсектици-
дами, а от крупных животных от-
правляют голову с двумя первыми шейными позвонками (рисунок 46).
Для постановки биопробы допуска-
ется использовать пробы мозга,
консервированные в 30 % - 50 %
растворе глицерина.
Патологический материал упа-
ковывают в пластмассовые мешки,
вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой,
пропитанной дезинфектантом. Мозг – в банку с притертой стеклянной или рези-
новой пробкой, залитую парафином, или любой другой водонепроницаемый кон-
тейнер. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрения в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача, отправляют с нароч-
ным.
Разрез трупа, удаление мозга, отбор проб и их исследования осуществляют при суровом соблюдении мероприятий по личной профилактике – надевают спецодежду, руки защищают двумя парами перчаток (хирургическими и анато-
мическими), глаза закрывают защитными очками, нос и рот прикрывают 6-
пластовой марлевой повязкой, надевают резиновый или полиэтиленовый фартук.
138
Схема лабораторной диагностики вируса бешенства
Методы проведения лабораторной диагностики
вирусологический |
биологический |
серологи- |
патогистологиче- |
||||
ческий |
ский |
||||||
|
|
|
|
||||
Микроскопическое |
исследование |
Заражение |
лабора- |
РСК, |
РП, |
Диссеминирован- |
|
срезов или мазков - отпечатков го- |
торных |
животных: |
ИФА, |
РН, |
ный негнойный по- |
||
ловного мозга на обнаружение телец |
белых мышей, кроли- |
РТГА, |
|
лиэнцефаломиелит |
|||
Бабеша-Негри; обнаружение рабиче- |
ков, морских свинок, |
ELISA |
|
лимфоидного типа |
|||
ского антигена методом МФА |
сирийских хомяков |
|
|
|
Диагноз на бешенство считается установленным при получении одного из следующих по-
казателей:
1.Выявлено при микроскопии в мазках-отпечатках или гистопрепаратах телец Бабеша-
Негри;
2.Обнаружено в нескольких полях зрения микроскопа при исследовании отпечатков с помощью МФА не менее 10 типичных гранул с ярким зеленым свечением. В контроле подобных образований нет;
3.Биопроба ставится, когда в патологическом материале не обнаружены тельца БабешаНегри и получены отрицательные результаты других исследований.
Лабораторная диагностика вируса бешенства включает в себя обнаружение вируса (антигена) в реакции иммунной флюоресценции (РИФ) и реакции диф-
фузной преципитации (РДП), окраску мазков на обнаружение телец Бабеша-
Негри и постановку биологической пробы. Также при диагностике вируса бешен-
ства можно применять и другие серологические реакции, такие как иммунофер-
ментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сам вирус можно выделить путем культивирования его на культурах клеток. Чаще всего на вирус бешенства проводится посмертная диагностика, но возможно и прижизненная ди-
агностика.
Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)
Быстрым и чувствительным методом диагностики бешенства является метод флуоресцирующих антител (МФА), основанный на микроскопическом исследо-
вании в ультрафиолетовых лучах отпечатков, мазков и криоконсервированных срезов тканей, обработанных антирабическим глобулином конъюгированным с флуоресцеин изотиоционатом
Для реакции биологическая промышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин. На обезжиренных предметных стеклах готовят
139
тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и пра-
вой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг).
Готовят не менее 2 препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).
Препараты высушивают на воз- |
|
духе, фиксируют в охлажденном аце- |
|
тоне (минус 15 - минус 20 °С) от 4 до |
|
12 ч, высушивают на воздухе, наносят |
|
флуоресцирующий гамма-глобулин, |
|
помещают во влажную камеру при 37 |
|
°С на 25-30 мин, затем тщательно |
|
промывают физиологическим раство- |
Рисунок 47 - Свечение гранул в |
|
ром или фосфатным буфером, споласкивают нейронах при бешенстве. РИФ.
дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.
Впрепаратах, содержащих вирус бешенства, наблюдаются разной величины
иформы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток (рисунок 47). В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсив-
ность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при от-
сутствии специфической флуоресценции.
Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя
исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, т.к. может быть флуорес-
ценция антигена вакцинного вируса.
В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином,
формалином, спиртом и т.д., а также материал, имеющий признаки даже незначи-
тельного загнивания.
140