2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

ют под люминесцентным микроскопом (объектив х40, окуляр х4 или х5). Поло-

жительная реакция - зеленое или изумрудно-зеленое свечение цитоплазмы кле-

ток. Реакция сопровождается постановкой соответствующих контролей. Диагно-

стический результат считают положительным при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5-10 сывороток, присланных из данного хозяйства.

Для определения уровня обнаруженных таким образом антител в испытуе-

мой сыворотке проводят ее титрование: испытуемую сыворотку разводят от 1:40

до 1:1280 и каждым разведением обрабатывают заведомо инфицированный пре-

парат, как было указано выше. О титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуе-

мой сывороткой в разведениях 1:10, 1:20 и 1:40, свидетельствует о том, что сыво-

ротка была получена в период острого переболевания животного ящуром, т.е. с

момента его заболевания прошло около 7 дней, а в разведениях 1:80 и выше - что сыворотка взята от животного-реконвалесцента.

Результаты исследования на ящур оформляют в виде протокола, в котором указывают дату исследования, наименование хозяйства, материала, краткие эпи-

зоотологические данные и т. д. и обязательно наименования компонентов, ис-

пользуемых в исследовании, характеристику контролей.

Специфическая терапия: сыворотка крови реконвалесцентов (переболев-

ших).

Специфическая профилактика: моно и поливалентные сорбированные вак-

цины из вируса, выращенного в организме 2-3 дневных крольчат (лапинизиро-

ванная); из вируса, культивированного по методу Френкеля на эпителии языка крупного рогатого скота; из вируса, выращенного на клетках ВНК-21.

171

Этиология. Picornaviridae, Aphtovirus (рисунок 62). Мелкие вирусы до 60 нм.

Содержит одну молекулу одноцепочечной позитивной РНК. Гемагглютинирую-

щими свойствами вирус не обладает. В настоящее время известно семь антиген-

ных типов вируса ящура: А, О, С,

Сат-1, Сат-2, Сат-3 и Азия-1. Внутри типов существуют варианты или подтипы. Так, тип А имеет 32 вари-

анта, тип О - 11, тип С - 5, Сат-1 - 7,

Сат-2 - 3, Сат-3 - 4, Азия-1 - 2. Ан-

тигенные типы, установленные в РСК, различаются и иммунологиче-

ски. Переболевшие животные приоб-

ретают выраженный иммунитет к

варианты. Каждый тип вызывает заболевание.

Культивируют на морских свинках, восприимчивых животных, культурах клеток из почки КРС, свиней коз и т.д.

Устойчивость. Чувствителен к изменению рН среды. Низкие температуры консервируют. Относительно чувствителен к дезинфектантам.

Патогенез. Вирус эпителиотропный. В местах проникновения вируса (рото-

вая полость или дыхательные пути) формируются первичные афты. Вирус → вос-

палительный процесс → отёк → много мелких пузырьков → они сливаются,

формируя афты. Экссудат в начале серозный, затем скопление лейкоцитов (гной-

ный) → афты лопаются → язвы → с кровью и лимфой разносится по организму

→ образование вторичных афт.

Иммунитет продолжительный от 1 года до 2 лет к данному типу возбуди-

теля. В организме естественно восприимчивых животных вирус индуцирует обра-

зование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

172

Перечень контрольных вопросов:

1.Патологический материал, отбираемый при ящуре.

2.Правила работы с ящурным материалом.

3.Приготовление антигена вируса ящура.

4.Подготовка гемолизина.

5.Учет реакции РСК.

6.Ретроспективная диагностика вируса ящура.

7.Возбудитель ящура.

8.Культивирование вируса.

9.Устойчивость вируса ящура.

10.Патогенез и клиническая картина ящура.

11.Вакцинация животных против ящура.

Тема 2.4. Дифференциация вирусов Ньюкаслской болезни и гриппа птиц

Цель: изучить методы лабораторной диагностики вируса гриппа птиц и нью-

каслской болезни, а также биологические особенности возбудителей.

Содержание:

отбор патологического материала при гриппе птиц и болезни Ньюкасла;

капельная реакция гемагглютинации;

РТГА;

некоторые сведения о вирусах гриппа и ньюкаслской болезни.

Патологический материал: головной мозг, легкие и селезенка. Вирус уда-

ется выделить из трупов или от больной птицы только в период вспышки болезни.

С целью обнаружения антител направляют по 25 проб сыворотки крови от птиц одного птичника. Через 2-3 недели от тех же (по номерам) птиц направляют для исследования еще 25 проб.

Капельная РГА. Каплю приготовленной из патматериала суспензии соеди-

няют с 1 каплей 5 % суспензии эритроцитов кур. Положительный результат - ге-

магглютинация.

173

Выделение вируса. Суспензию из патматериала вводят 9-11-дневным кури-

ным эмбрионам в аллантоисную полость. При размножении в них вируса эмбрио-

ны гибнут через 20-76 ч в зависимости от вирулентности штамма вируса. При вскрытии павших эмбрионов отмечают множественные кровоизлияния на темени,

теле и лапках зародыша. Аллантоисную жидкость павшего эмбрион отсасывают,

устанавливают капельной РГА присутствие в ней вируса и используют при даль-

нейших исследованиях как материал, содержащий выделенный вирус. Если при первом заражении не удается выделить вирус, то делают до 3-х последовательных

«слепых» пассажей. При этом используют для заражения аллантоисную жидкость эмбрионов, давших в предыдущем пассаже отрицательную реакцию.

Если выделенный вирус при дальнейших исследованиях окажется вирусом ньюкаслской болезни, необходимо выяснить, является ли он вакцинным или эпи-

зоотическим. На патогенность полевого изолята будет указывать положительная биопроба на 3-6 непривитых цыплятах в возрасте 30 и более дней. Цыплят зара-

жают внутримышечно 0,2 мл аллантоисной жидкости или суспензии органов по-

гибшей птицы. При наличии полевого вируса птица погибает через 4-6 дней.

Дифференциация вируса гриппа от вируса ньюкаслской болезни в РТГА

При заражении куриных эмбрионов нельзя дифференцировать грипп птиц от болезни Ньюкасла, т.к. признаки размножения вирусов в эмбрионах сходны. Спе-

цифическое действие вирусы проявляют только в РТГА с эритроцитами кур (оба вируса агглютинируют эритроциты).

При дифференциации обоих вирусов в РТГА используют две специфические сыворотки, одна из которых содержит антитела к вирусу болезни Ньюкасла, а дру-

гая - к вирусу гриппа птиц (к определенному серологическому варианту).

Дифференциация вирусов в РТГА может быть проведена постановкой ее в одной из двух модификаций.

Согласно первой готовят для РТГА рабочее разведение вируса с титром 4 ГАЕ.

Затем берут две специфические сыворотки биофабричного производства и опреде-

ляют титры антител в обеих сыворотках в присутствии выделенного вируса.

174

В приведенном примере гемагглютинирующая активность неизвестного ви-

руса подавлена (тормозится) антителами, содержащимися в специфической сыво-

ротке к вирусу гриппа птиц.

Это является косвенным доказательством образования комплекса антиген +

антитело (выделенный вирус + антитела специфической сыворотки). В то же вре-

мя добавление к вирусу сыворотки, содержащей антитела к вирусу ньюкаслской болезни, никак не отразилось на гемагглютинирующей способности вируса, т.е.

комплекса не образовалось. Это дает основание утверждать, что неизвестный ви-

рус, выделенный из патматериала, является вирусом гриппа птиц.

Вторая модификация заключается в том, что используются двукратные раз-

ведения неизвестного выделенного вируса и постоянные дозы специфических сы-

вороток, содержащих антитела к ньюкаслской болезни и гриппу птиц. При этом обе используемые сыворотки берутся в реакцию в одинаковых титрах. Компонен-

ты реакции объединяются в одинаковых объемах (например, 0,2 мл).

Одновременно ставят контроли специфических сывороток и контроль эрит-

роцитов на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

После экспозиции 40-60 мин, в течение которых взаимодействуют специфи-

ческие компоненты реакции, в каждую лунку добавляют по 6,2 мл 1 % взвеси ку-

риных эритроцитов. Через 30-40 мин учитывают результаты реакции.

Таким образом, вирусы болезни Ньюкасла и гриппа птиц, вызывая сходно проявляющиеся болезни птиц и однотипно обнаруживающиеся при биопробе на эмбрионах, четко дифференцируются РТГА. При сомнительных результатах РТГА вирус идентифицируют в РН.

ЦПД и гемадсорбирующее действие.

Устойчивость низкая. Инактивируется под действием 3 % едкого натра и фенола, 0, 1% формальдегида. Лиофилизация – 2 года.

Патогенез. Заражение воздушно-капельным путем. Вирус проникает в орга-

низм, с эритроцитами разносится по всему организму, размножается в паренхи-

матозных органах, вызывая интоксикацию и гибель птиц.

Иммунитет не менее 1 года приобретают к гомологичному типу вируса.

Могут иметь пассивный иммунитет от иммунных матерей.

Специфическая терапия не разработана.

176

Специфическая профилактика: инактивированная гидроксиламиновая эм-

брион-вакцина типа А; инактивированная жидкая или сухая вакцина против гриппа птиц типа А1.

Вирус ньюкаслской болезни

Этиология. РНК, Paramyxoviridae, Paramyxovirinae, Rubulavirus (рисунок 64). 150 - 300 нм. Меняют форму в зависимости от стадии развития. Оболочечный.

Геном - одноцепочечная негативная РНК.

Вирус обладает гемагглютинирующими свойствами.

Культивируют на 9-12 дневных ку-

риных эмбрионах, первичных и переви-

ваемых культурах клеток (фибробласты

лучи – 2 дня, рассеивающий свет 15 дней, в птичнике зимой - 140 дней, летом - 7

дней. В замороженных трупиках кур – 800 дней.

Патогенез. Заражение происходит алиментарно, аэрогенно. Вирус проникает в кровь и с кровью разносится в различные органы и ткани, вызывает поражение центральной нервной системы, органов дыхания, пищеварения, вызывает инток-

сикацию и кровоизлияния.

Специфическая профилактика: живые вакцины из штамма Н, штамма БОР-

74, штамма LASOTA, штамма В1; вакцина против инфекционного бронхита кур и болезни Ньюкасла; ассоциированная инактивированная эмульсионная против бо-

лезни Ньюкасла и реовирусной инфекции птиц; ассоциированная инактивирован-

ная эмульсионная против синдрома снижения яйценоскости и болезни Ньюкасла;

ассоциированная инактивированная эмульсионная против синдрома снижения яйценоскости, болезни Ньюкасла и инфекционной бурсальной болезни кур; ассо-

циированная инактивированная эмульсионная против инфекционного бронхита кур, болезни Ньюкасла и инфекционной бурсальной болезни кур; ассоциирован-

177

ная инактивированная эмульсионная против синдрома снижения яйценоскости,

болезни Ньюкасла и инфекционного бронхита кур; ассоциированная инактивиро-

ванная эмульсионная против болезни Ньюкасла и инфекционного бронхита кур.

Перечень контрольных вопросов:

1.Патологический материал, отбираемый при гриппе птиц, ньюкаслской болезни.

2.Постановка капельной РГА.

3.Постановка РТГА с разведениями вируса при дифференциации двух ви-

русов.

4.Возбудители гриппа и ньюкаслской болезни.

5.Культивирование вирусов.

6.Устойчивость вирусов.

7.Патогенез и клиническая картина гриппа птиц и ньюкаслской болезни.

8.Вакцинация птиц против гриппа и ньюкаслской болезни.

РАЗДЕЛ 3. ОБЩАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Тема 3.1. Основы и методы культивирования микроорганизмов-

продуцентов

Цель: изучить основные виды микроорганизмов продуцентов и способы их культивирования

Содержание:

бактерии;

актиномицеты;

грибы;

водоросли;

простейшие;

методы культивирования продуцентов;

принцип и конструкции биореакторов.

Из громадного разнообразия (более 2 млн. видов) живых организмов нашей

178

планеты в биотехнологии исследуются для применения в качестве продуцентов и используются непосредственно лишь сотая доля процента.

В настоящее время в биотехнологии в качестве продуцентов используются одноклеточные и многоклеточные организмы, построенные из клеток одного типа

(бактерии, грибы, водоросли), а также клетки и ткани высших растений и живот-

ных. Объектами биотехнологии являются ферменты, нуклеиновые кислоты, про-

стагландины, лектины, нейропептиды и различные БАВ.

В промышленной биотехнологии применяют 3 вида штаммов:

 природные штаммы, улучшенные естественным и искусственным отбо-

ром (при производстве микробной биомассы);

штаммы, полученные в результате индуцированного мутагенеза;

генноинженерные штаммы (обладают самой высокой генетической не-

стабильностью).

Промышленные штаммы должны удовлетворять следующим требованиям:

безвредность для потребителя и обслуживающего персонала;

высокая скорость роста биомассы и целевого продукта (БАВ) при эконо-

мичном потреблении питательной среды;

 направленная биосинтетическая активность при минимальном образова-

нии побочных продуктов;

генетические однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования;

отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках;

устойчивость к фагам и другой посторонней микрофлоре;

способность расти на дешевых и доступных субстратах, отходах пищевой

ихимической промышленности при высокой плотности клеток.

Только по совокупности этих и других свойств можно оценить полезность и рентабельность продуцента. Наиболее изучены и чаще применяются в биотехно-

логии бактерии рода Clostridium, Thermoanaerobacter, Bacillus, Acetobacter, Pseudomonas, Brefibacterium.

179

Бактерии имеют очень высокую скорость размножения, их клетки делятся через 30-60 минут (некоторые виды через 8-10 минут). Они могут перерабатывать в сутки объем биомассы, превышающий массу клетки в 30-40 раз (масса 10-12 г,

объем – 10-12 мл), и за 2-4 суток способны образовывать биомассу 1010 т. Возмож-

ности бактерий к быстрому размножению намного превосходят другие виды ор-

ганизмов, и это их свойство является важнейшим при производстве микробного белка и БАВ. Бактерии биохимически универсальны в том смысле, что могут ус-

ваивать самые разнообразные питательные вещества и даже способны выбирать наилучшие органические соединения из смеси, поэтому могут приспосабливаться к самым разнообразным условиям существования.

Большинство бактерий культивируют на сложных органических средах, со-

держащих факторы роста (витамины, аминокислоты, пурины, пиримидины). Про-

дуценты, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофами, штаммы, не обнаруживающие эту потребность, прототрофами. Молочнокислые бактерии можно отнести к ауксотрофам. Многие продуценты могут расти на синтетических средах, содержащих всего одно органическое вещество в качестве источника уг-

лерода.

Особое значение как продуценты имеют архебактерии, древние представите-

ли прокариот. Они обитают в средах с экстремальными условиями (высокие кон-

центрации неорганических веществ, повышенные температуры). Среди архебак-

терий галобактерии представляют большой интерес для биотехнологии. Они рас-

тут в среде, содержащей 20-30 % NaCl (концентрированный раствор, Мертвое мо-

ре), живут на сухой соленой рыбе, кожаных изделиях, имеют белки, нормальное функционирование которых происходит только при высоких концентрациях

NaCl. Это палочки и кокки, содержащие фотоактивные пигменты бактериородоп-

син и галородопсин. Галородопсин способен превращать электромагнитную энер-

гию света в химическую энергию, за счет которой происходит фосфорилирование и синтез АТФ. Если пурпурные бактерии Halobacterium иммобилизовать на носи-

теле, то при освещении можно получать электричество, АТФ и обессоливать мор-

скую воду.

180