2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Рисунок 38 - Elisa-тест.

1) в лунки микропанелей вносят по 0,2 мл гамма-глобулина в нужной кон-

центрации в натрий-карбонатном буфере с рН 9,6;

2)микропанели инкубируют в течение часа при 37°С и далее оставляют на ночь при 4 °С;

3)наутро из лунок удаляют раствор глобулинов, микропанели промывают 3

раза по 5 мин калийфосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,05 % твина-20;

4) в лунки вносят по 0,2 мл раствора, содержащего исследуемый антиген, и

инкубируют при 37 °С 2 ч. В контрольные лунки вносят заведомо известные по-

ложительный и отрицательный антигены;

5)микропанели промывают, как и в п. 3;

6)далее в лунки вносят по 0,2 мл иммуноферментного конъюгата и панели инкубируют 1-2 ч при 37 °С;

7)микропанели промывают, как в пп. 3 и 5;

8)далее в лунки вносят по 0,2 мл раствора субстрата: ортофе-нилендиамина

(ОФД) или 5-аминосалициловой кислоты (для пероксидазы) и р-

нитрофенилфосфата (для щелочной фосфатазы), инкубируют в темноте при ком-

натной температуре 5-30 мин;

9) реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 н. серной кислоты (Н S04)

(для пероксидазы) и 3 М NaOH (для щелочной фосфатазы);

121

тельные образцы имеют оранжево-коричневую окраску (рисунок 39), а при приме-

нении 5-аминосалициловой кислоты опытные образцы окрашиваются в интенсив-

но-коричневый цвет, в то время как отрицательный контроль либо совсем не ок-

рашен, либо окрашен в слабо-желтый цвет. При использовании щелочной фосфа-

тазы опытные образцы окрашены в желтый цвет.

мым параметром в этих случаях была или начальная скорость ферментативной

122

реакции, или конечная оптическая плотность продукта, образовавшегося за опре-

деленный промежуток времени (рисунок 40).

При отсутствии специального оборудования учет результатов ИФА может эффективно проводиться на струйных спектрофотометрах, флуориметрах, фото-

электрокалориметрах. Достоверность результатов анализа при этом несколько снижается и уменьшается число проб, которое могло бы быть проанализировано за рабочий день.

Часто ценной является качественная информация о наличии или отсутствии данного соединения в исследуемой пробе. В этих случаях учет результатов ИФА можно проводить визуально, по появлению окрашенного продукта ферментатив-

ной реакции. Эта особенность метода крайне важна при необходимости массовых исследований вдали от стационарных лабораторных центров.

Перечень контрольных вопросов:

1. Постановка гистохимического варианта ИФА: прямой пероксидазный

тест.

2. Постановка гистохимического варианта ИФА: непрямой пероксидазный

тест.

3.Постановка твердофазного иммуноферментного анализа (Elisa-тест).

4.Задачи, которые можно решить с помощью ИФА.

5.Достоинства ИФА.

6.Подготовка препаратов к исследованию.

7.Субстраты, используемые при ИФА.

8.Учет результатов в ИФА.

Тема 1.12. Метод ДНК-зондов

Цель: изучить принцип действия и способ постановки метода ДНК-зондов

Содержание:

принцип метода ДНК-зондов;

получение ДНК-зонда;

подготовка вируссодержащего материала к исследованию;

123

задачи, которые можно решить с помощью метода ДНК-зондов;

достоинства метода ДНК-зондов;

недостатки метода ДНК-зондов.

Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты (в том числе и вирусные) в любых материалах, включая патматериал от больных живот-

ных. Он основан на способности одноцепочных молекул нуклеиновых кислот со-

единяться в двухцепочные, если они взаимно комплементарны.

Пуриновые основания (А и Г) способны связываться с пиримидиновыми (Т,

Ц и У) водородными связями. Поэтому и соответствующие нуклеотиды могут связываться между собой парами А - Т и Г - Ц. Это свойство называется компле-

ментарностью. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновые кислоты)

способны связываться водородными связями в одну двухцепочную, если после-

довательность нуклеотидов одной точно соответствует последовательности нук-

леотидов другой так, что их азотистые основания могут образовать пары А - Т и Г

- Ц. Такие две молекулы ДНК называются взаимно комплементарными. Ими могут быть не только две молекулы ДНК или две молекулы РНК, но и ДНК с РНК (при этом вместо пары А - Т образуется А - У). Например, две молекулы ДНК, имею-

щие следующие последовательности нуклеотидов:

1.А А Г Ц А Т Г Г Ц Т ……….Ц А А А Г Т

2.Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А ……….Г Т Т Т Ц А

являются взаимно комплементарными. Если смесь таких нуклеиновых кислот подержать при 55 °С, то примерно через 2 ч образуются двухцепочные молекулы ДНК следующего состава:

А А Г Ц А Т Г Г Ц Т ……….Ц А А А Г Т Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А ……….Г Т Т Т Ц А

Поскольку исходные одноцепочные молекулы могут происходить из разных источников, этот процесс удвоения молекул называется молекулярной гибриди-

зацией. Нагрев материала, содержащего двухцепочные ДНК, до 80 °С или обра-

ботка его щелочью приводят к разделению двухцепочных молекул на одноце-

почные, что называется денатурацией.

124

Любой вирус включает одну специфичную для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы обнару-

жить вирусную нуклеиновую кислоту в материале от больного животного, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двухцепоч-

ная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеи-

новой кислоты, предварительно как-либо помеченной. Такая меченая одноцепоч-

ная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой ки-

слоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку или в виде атомов радиоактивного фосфора (Р32), или в виде биотина, дающего изменение цвета, что позволяет обна-

руживать зонд, а значит, и вирусную нуклеиновую кислоту, с которой зонд со-

единился в результате молекулярной гибридизации.

Методика обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом ма-

териале включает следующие этапы:

1.получение ДНК-зонда и его метка;

2.подготовка патматериала к исследованию;

3.молекулярная гибридизация и удаление одноцепочных нуклеиновых кислот;

4.обнаружение двухцепочных нуклеиновых кислот, включивших в себя зонд

(по метке);

5.интерпретация результатов.

Получение ДНК-зонда сводится к тому, что из материала от больного живот-

ного выделяют вирус, на который хотят получить ДНК-зонд. ДНК этого вируса разрезают на фрагменты (с помощью рестриктаз). Методом электрофореза выде-

ляют тот фрагмент, который неизменно обнаруживается в ДНК вирусов разного происхождения и является наиболее консервативным.

Из бактерий кишечной палочки выделяют те плазмиды, которые содержат ген фермента, разрушающего какой-либо антибиотик (например, ген пеницилли-

назы). Кольцевые плазмиды с помощью рестриктазы разрезают, превращая их в линейные, и к ним с помощью лигазы пришивают выделенный фрагмент вирус-

ной ДНК. Плазмидные ДНК с вирусными вставками вводят в бактерии, которые

125

Рисунок 41 - Получение ДНК-зонда.

затем клонируют в селективной среде, содержащей антибиотик, к которому бак-

терии стали нечувствительными. Накапливают массу бактерий и из них выделяют плазмидную ДНК (путем удаления белка). Выделенную плазмидную ДНК, со-

держащую вирусные вставки, метят радиоактивным фосфором (Р32) путем ник-

трансляции и денатурируют путем нагрева до 80 °С. Образовавшиеся одноцепоч-

ные молекулы ДНК будут иметь фрагменты, комплементарные фрагментам одной из нитей ДНК-вируса. Это и есть ДНК-зонд (рисунок 41).

Для получения ДНК-зонда на вирусную РНК выбирают на основе анализа ге-

нетической карты вируса необходимый фрагмент РНК, выделяют его, а затем пу-

тем обратной транскрипции получают ДНК-фрагмент, который и встраивают в плазмиду. Обычно ДНК-зонд готовят на каждый вирус заранее, нарабатывают его и хранят до использования.

126

С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий ма-

териал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженый и даже частично разложившийся.

Из подлежащего исследованию материала выделяют ДНК, для чего его гомо-

генизируют, суспендируют, центрифугируют и надосадочную жидкость обраба-

тывают препаратами, разрушающими белки (сначала протеиназой К, затем фено-

лом с хлороформом). После полного удаления белков осаждают ДНК при минус 70 °С, осадок отмывают спиртом и подвергают денатурации путем кипячения или обработки щелочью.

Полученные пробы из разных исследуемых материалов наносят на микропо-

ристую капроновую или нейлоновую мембрану (фильтр), расчерченную простым карандашом на квадраты (для каждого материала свой номер квадрата). Также наносят отрицательный и положительный контроли. Зонд наносят на стекло, ко-

торое затем накладывают на фильтр так, чтобы получился контакт зонда с иссле-

дуемым материалом, и 20 мин выдерживают при 80 °С, после чего температуру снижают до 55 °С, при которой идет гибридизация (около 2 ч). Затем фильтр от-

деляют от стекла, промывают, сушат и удаляют с него все несвязавшиеся одноце-

почные молекулы ДНК, обрабатывая додецилсульфатом и цитратом натрия. Ме-

тодом авторадиографии устанавливают, в каких квадратах выявляется радиоак-

тивность, и визуально оценивают ее интенсивность (путем сравнения с контроля-

ми). Потемнение фотопленки, контактировавшей с определенными квадратами,

свидетельствует о наличии в материалах этих квадратов искомой нуклеиновой кислоты вируса.

Учитывать результаты при использовании радиоактивной метки кроме авто-

радиографии можно и путем подсчета импульсов в счетчике.

Использование радиоактивной метки для зонда является довольно большим недостатком метода, и поэтому разрабатываются другие методы метки зонда, в

том числе присоединение к зонду метки, изменяющей цвет субстрата.

127

Метод молекулярных зондов перспективен, так как позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты любых вирусов, для которых получен зонд. Однако иссле-

дования этим методом технически довольно сложны и трудно выполнимы.

Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:

получение одноцепочного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-

зонда) и его метка.

выделение из патматериала нуклеиновых кислот и их денатурация (рас-

плетение двухцепочных молекул на одноцепочные).

контакт образовавшихся одноцепочных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-

зондом при 55 °С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молеку-

лярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.

удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеино-

вых кислот.

обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нук-

леиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса,

на который был получен ДНК-зонд.

Достоинства метода ДНК-зондов: высокие чувствительность и специфич-

ность, универсальность, отсутствие стерильности и математических расчетов.

Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность полу-

чения ДНК-зонда.

Перечень контрольных вопросов:

1.Принцип метода ДНК-зондов.

2.Молекулярная гибридизация.

3.Денатурация.

4.Комплементарность.

5.Получение ДНК-зонда.

6.Подготовка вируссодержащего материала к исследованию.

7.Задачи, которые можно решить с помощью метода ДНК-зондов.

8.Достоинства и недостатки метода ДНК-зондов.

128

Тема 1.13. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Цель: изучить принцип действия и способ полимеразой цепной реакции

(ПЦР)

Содержание:

Принцип ПЦР;

Постановка ПЦР;

Учет результатов ПЦР;

Задачи, которые можно решить с помощью ПЦР;

Достоинства и недостатки ПЦР.

ПЦР основан на размножении в пробирках уникальных участков генов виру-

са или бактерий в миллионы и миллиарды раз за 2-3 ч при помощи фермента тер-

мостабильной ДНК-полимеразы. Метод получил название ПЦР от англ. Polymerase Chain Reaction, PCR.

Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. Амплифицируемый участок именуют амплификоном. Его границы определяются двумя олигонуклеотидными

праймерами (затравками) – отрезки одноцепочечной ДНК длиной 20-30 нуклеоти-

дов, комплементарные каждой из цепей ДНК-матрицы и служащие затравкой для синтеза новой цепи ДНК, комплементарными определенным последовательностям в составе противонаправленных нитей двухцепочной ДНК (рисунок 42).

129

Рисунок 42 - Циклы ПЦР.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью ДНК-полимеразы, осуще-

ствляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух прай-

меров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ог-

раничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифи-

цировать. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинте-

зирующихся молекул ДНК (рисунок 43).

Из рисунка видно, что каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементар-

ной ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо лишь денатурировать (це-

пи ДНК расходятся) образовавшиеся в результате первой стадии реакции двухце-

почной молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоеди-

ниться к ДНК и осуществить с помощью ДНК-полимеразы элонгацию (синтез ДНК-достройки праймера).

Эти три стадии:

 денатурация ДНК (плавление);

130