2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

ка защитила 100 % куриных эмбрионов от действия вируса); d - коэффициент разведения (он равен 2); r - количество положительно реагирующих (на сыворотку) куриных эмбрионов; п - количество тест-объектов (куриных эмбрионов) при испытании каждого разведения (в нашем примере по 4 эмбриона).

Подставим в формулу значения букв из таблицы и получаем

Значит, сыворотка в разведении 10м25 = 1:10-1,425 защищает 50 % куриных эм-

брионов от действия 100 ЭЛД50 вируса ньюкаслской болезни. По таблице антилога-

рифмов находим, что 1:10-1,425 = 1:26,5. Следовательно, титр антител в сыворотке

Т=1:26,5.

Постановка рН с разведением вируса.

1. Готовят два ряда последовательных 10-кратных разведений вируса в оди-

наковых объемах (количество разведений зависит от титра вируса).

2.Ко всем разведениям первого ряда добавляют в том же объеме испытуемую сыворотку (в небольшом разведении).

3.Ко всем разведениям второго ряда добавляют в том же объеме нормальную сыворотку, т.е. животного того же вида, в том же разведении и тем же методом освобожденную от неспецифических ингибиторов вирусов, что и испытуемая, но заведомо не содержащую антител к взятому вирусу.

4.Все смеси вируса с испытуемой и нормальной сыворотками выдерживают установленное время при определенной температуре в зависимости от вируса.

5.Каждой смесью в одинаковых дозах заражают равные группы тест-

объектов, чувствительных к взятому вирусу.

6. Учитывают результат заражения по каждой группе тест-объектов, считая за положительный результат действие вируса, а за отрицательный - отсутствие дей-

ствия.

7. Рассчитывают титр вируса в присутствии исследуемой сыворотки (TAS+SS) и

91

титр вируса - в присутствии нормальной сыворотки (TAS+SN).

8. Определяют, во сколько раз TAS+SS ниже, чем TAS+SN. Это число называется индексом нейтрализации (ИН). Он тем больше, чем выше концентрация антител в ис-

пытуемой сыворотке.

Считается, что если ИН меньше 10, антител к использованному вирусу в ис-

пытуемой сыворотке нет, а если ИН больше 100, антитела достоверно есть (ИН от

10 до 100 - сомнительный результат).

Если просчитать титры вируса в присутствии испытуемой, а также нормальной сывороток, то получим TAS+SS = 102 ЭД50/мл и TAS+SN = 105 ЭД50/мл. Отсюда

Таким образом, РН с разведениями сыворотки позволяет определить титр ан-

тител в исследуемой сыворотке, показателем которого (а значит, и концентрации)

служит разведение сыворотки, защищающее 50 % тест-объектов от действия 100

ЭД50 вируса. РН с разведением вируса позволяет определить, во сколько раз анти-

тела исследуемой сыворотки способны снизить титр вируса путем нейтрализации

92

его инфекционной активности. Это абстрактное число, называемое индексом ней-

трализации, также является показателем концентрации антител в сыворотке. Оче-

видно, что чем выше концентрация антител в сыворотке, тем выше будет индекс нейтрализации.

Реакция нейтрализации позволяет решить следующие задачи:

1)определить титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, или ИН;

2)идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками;

3)установить антигенное родство между вирусами.

Достоинства РН: универсальность и высокая специфичность.

Недостатки РН: большая трудоемкость; стерильность материалов и инст-

рументов; высокая стоимость живых тест-объектов; математические расчеты;

длительность биопробы.

Следует всегда помнить, что сыворотки, идущие в РН, должны быть предва-

рительно освобождены от термолабильных неспецифических ингибиторов виру-

сов путем их прогревания (в разведенном не менее чем в 2 раза виде) в течение 30

мин при температуре от 56 до 63 °С в зависимости от вида животного, от которо-

го получена сыворотка. Так, сыворотки лошади и морской свинки требуют про-

гревания при 56 °С, кур - при 58,

крыс и кроликов - при 60 °С.

РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП)

Принцип РДП: в слое агаро-

вого геля делают несколько лу-

нок, в которые наливают антиге-

ны и сыворотки так, чтобы они находились соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки на-

Рисунок 21 - РДП.

93

чинают диффундировать в слой геля во все стороны от каждой лунки. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципи-

тирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации (рисунок

21), которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля. Если же диффундирую-

щие друг другу навстречу антиген и сыворотка негомологичны, полосы преципи-

тации не образуется.

Задачи РДП:

1. обнаружение в сыворотке крови антител, гомологич-

ных данному антигену (например, вирусу), производится при помощи схемы РДП, показанной на рисунке 22. Если в сыво-

ротке S содержатся антитела к антигену AS, между лун-

AS;

вующая между остальными лунками (рисунок 23);

3. идентификация неизвестного вируса может быть произ-

ведена в РДП по схеме, показанной на рисунке 24. Здесь AS -

неизвестный антиген; SS1...SS6 - сыворотки, содержащие

антитела к известным антигенам. Если полоса преципита- Рисунок 24 - РДП для

идентификации вируса.

ции образовалась, например, между лунками с AS и SS3, значит,

исследуемый антиген гомологичен антителам сыворотки SS3;

4. титрование антител сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным анти-

геном (в нашем примере 1:16), служит показателем титра Рисунок 25 - Титрова-

ние сыворотки в РДП.

94

антител в сыворотке SS (рисунок 25).

Рисунок 26 - Реакция иммунной диффузии (на лейкоз крупного рогатого скота).

РДП часто используют для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

(под названием реакции иммунодиффузии - РИД) и ИНАН (инфекционной ане-

мии лошадей). В обоих случаях задача сводится к обнаружению в сыворотках крови антител к соответствующим вирусам (рисунок 26).

Реакция радиальной иммунодиффузии: иммунную сыворотку с расплавлен-

ным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген,

диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.

Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов раз-

личных классов, компонентов системы комплемента и др.

Большое значение имеет чистота агара, лучше пользоваться очищенным ага-

ром Дифко. Специфические антигены и сыворотки должны быть в высоких тит-

рах, обеспечивающих образование комплекса антиген + антитело в количестве,

достаточном для образования четко видимой полосы преципитации.

Постановка РДП. Обезжиренные предметные стекла укладывают горизон-

тально на холодную поверхность (можно на стол). Пипеткой набирают 1,5-2 мл

95

агара, нагретого до 60 °С, и зигзагообразным движением выливают его сначала по периметру предметного стекла, а потом быстро заполняют его середину, следя за тем, чтобы не образовывались пузыри и волны. Стекла с налитым агаром (слой

1,5-2 мм), оставляют лежать 5-10 мин для затвердения агара (превращения золя в гель). В слое застывшего агара вырезают лунки. Их количество и взаимное распо-

ложение определяются целью, с которой ставят РДП, но диаметр лунок должен быть около 5 мм, а расстояние между соседними лунками 3-4 мм. Наиболее часто используют два типа расположения лунок.

Для вырезания лунок можно использовать готовый штамп (трубочки с ост-

рыми краями, жестко скрепленные в соответствии с типом расположения и коли-

чеством лунок). Если готового штампа нет, можно воспользоваться любой труб-

кой подходящего диаметра, например гильзой от патрона к мелкокалиберной (ка-

либр 5,6) винтовке. В этом случае целесообразно нарисовать карандашом на бу-

маге количество и взаимное расположение лунок и, подложив этот трафарет под стекло с агаром, по нему вырезать лунки. Остающийся в лунках агар можно из-

влечь иглой, ученическим пером или пастеровской пипеткой. У образовавшихся лунок дном служит стекло, а стенками - слой агара. Чтобы избежать подтекания жидкостей под агар, рекомендуют лунки заплавить, с тем, чтобы они были полно-

стью в слое агара. Для этого пользуются разными приемами: пастеровской пипет-

кой в лунку вносят горячий (50-60 °С) агар и тотчас отсасывают его обратно. Со-

прикасаясь на короткое время с холодным дном и стенками лунки, агар успевает частично застыть и покрыть тонким слоем дно и стенки лунки. Однако если стек-

ла хорошо обезжирены и застывший слой агара прочно сцеплен со стеклом (не

«плывет» при наклоне), то и без дополнительной заливки лунок полосы преципи-

тации образуются нормально.

В подготовленные лунки заливают компоненты РДП: антигены и сыворотки.

Нужно следить, чтобы компоненты ни в коем случае не переливались через край лунок, а только заполняли объем каждой. Для этого их лучше заливать мелкими каплями с помощью тонко оттянутых пастеровских пипеток.

96

После заливки компонентов РДП предметные стекла помещают во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание агара.

В качестве влажной камеры можно использо-

вать любую закрывающуюся емкость (эксика-

тор, чашку Петри), в которую положены намо-

ченные водой вата или фильтровальная бумага.

Влажную камеру оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (в тер-

мостате диффузия идет быстрее, но незначи-

тельно).

Предварительный учет результатов

Постановка РДП в чашках Петри по технике принципиально не отличает-

ся от постановки на предметных стеклах, только тогда слой агара наливают тол-

щиной до 3 мм, лунки делают большего диаметра и на большем расстоянии. Но в этом случае время учета отодвигается до 5-7 дней.

Методика РДП в капиллярах не нашла широкого применения в практике.

Препараты РДП на предметных стеклах можно через 48-72 ч высушить и ок-

расить раствором амидного черного. Это позволяет сохранять препарат неопреде-

ленно долго и улучшает возможности фотографировать полосы преципитации.

Достоинства РДП: простота техники постановки, быстрота получения от-

вета, не требует стерильности, минимальная потребность в компонентах, пригод-

ность для работы с любыми растворимыми антигенами, возможность документи-

рования результата путем фотографирования.

Но все эти достоинства существенно умаляются ее основным недостатком -

низкой чувствительностью. Тем не менее, РДП достаточно широко пользуются в лабораторной диагностике вирусных болезней животных.

97

Перечень контрольных вопросов:

1.Принцип реакции нейтрализации.

2.Модификации реакции нейтрализации.

3.Подготовка сывороток к исследованию.

4.Индекс нейтрализации.

5.Задачи реакции нейтрализации.

6.Достоинства и недостатки реакции нейтрализации

7.Принцип РДП.

8.Модификации РДП.

9.РИД.

10.РРИД.

11.Задачи РДП.

12.Учет результатов РДП.

13.Достоинства и недостатки РДП.

Тема 1.9. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция не-

прямой гемагглютинации (РНГА)

Цель: изучить принцип действия и способ постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Содержание:

принцип РТГА;

задачи, которые можно решить с помощью РТГА;

титр сыворотки в РТГА;

постановка РТГА;

достоинства РТГА;

недостатки РТГА;

принцип РНГА;

задачи, которые можно решить с помощью РНГА;

титр сыворотки в РНГА;

постановка главного опыта РНГА;

98

приготовление эритроцитарных диагностикумов;

достоинства РНГА;

недостатки РНГА.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эрит-

роцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации — на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител и вируса (рисунок 28).

Рисунок 28 - Принцип РГГА.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количе-

ственных соотношениях, поэтому необходимо делать разведения вируса либо сы-

воротки.

РТГА позволяет решать следующие задачи:

1.определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке;

2.идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по извест-

ным сывороткам;

3. установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной

работы, специфичность, дешевизна.

99

Недостаток: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА:

 готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуе-

мой сыворотки в одинаковых объемах (по 0,25 или 0,2 мл);

 к каждому разведению до-

бавляют такие же объемы гомоло-

гичного вируса в титре 4 ГАЕ

(гемагглютинирующие единицы);

 смеси выдерживают опре-

деленное время при определенной температуре (для вируса нью-

каслской болезни 40-60 мин при

равные объемы 1 % суспензии отмытых эритроцитов;

 после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах

(рисунок 29).

Предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит

гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворот-

ке.