2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)
.pdfРезультат |
|
- |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
+++ |
|
+++ |
|
+++ |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Продолжение таблицы |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Контроль |
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
Компоненты реакции |
|
|
сыво- |
|
эритро- |
|
|
|
|
ГАЕ вируса |
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
ротки |
|
цитов |
|
2 |
|
1 |
|
½ |
|
¼ |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Физиологический раствор, мл |
|
|
0,2 |
|
0,4 |
|
|
0,4 |
|
0,4 |
|
0,4 |
|
0,4 |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Сыворотка, мл |
|
|
|
0,2 |
|
- |
|
|
- |
|
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Вирус Т=4 ГАЕ, мл |
|
|
|
- |
|
|
- |
|
|
0,4 |
|
Перенос по 0,4** |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
Контакт вируса с сывороткой |
|
|
|
40-60 минут при комнатной температуре |
|
|||||||||||||||
Эритроциты 1 %, мл |
|
|
|
0,4 |
|
0,4 |
|
|
0,4 |
|
0,4 |
|
0,4 |
|
0,4 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
Экспозиция |
|
|
|
30-40 минут при комнатной температуре |
|
|||||||||||||||
Результат |
|
|
|
- |
|
|
- |
|
|
+++ |
|
++ |
|
- |
|
- |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
*Из последней лунки удалить 0,2 мл.
**Из последней лунки удалить 0,4 мл.
Вприведенном примере высшим разведением сыворотки, еще полностью тормозящим гемагглютинацию, является 1:32, и титр антител записывают Т = 1:32. Запомним, что титр антител в сыворотке всегда выражается наибольшим разведением сыворотки, еще дающим определенный эффект при взаимодействии
с гомологичным антигеном.
Чем ниже титр вируса, взятого в РТГА, тем меньшие концентрации антител можно обнаруживать в сыворотке (а значит, тем выше будет их титр). Титр виру-
са 4 ГАЕ - наиболее низкий, еще позволяющий получать уверенную гемагглюти-
нацию, т.к., будучи разведенным равным объемом сыворотки, он понижается в каждой лунке до 2 ГАЕ. Это значит, что при добавлении в каждую лунку 1% сус-
пензии эритроцитов в объеме, равном суммарному объему вируса и сыворотки,
количество вирионов будет необходимое для агглютинации всех 100% эритроци-
тов (1 ГАЕ вируса агглютинирует 50 % эритроцитов в 1 % суспензии).
На точность определения титра антител влияет и кратность разведения сыво-
ротки. Чем она меньше, тем точнее будет определен титр антител.
101
Следует всегда иметь в виду, что идущие в РТГА сыворотки необходимо предварительно освобождать от термостабильных неспецифических ингибиторов вирусов, обладающих способностью ингибировать гемагглютинирующие свойст-
ва вирусов. С этой целью сыворотки обрабатывают одним из следующих веществ:
углекислым газом (С02), периодатом калия (КIO4), этакридина лактатом (ривано-
лом), каолином, активированным углем, экстрактом холерного вибриона и др.
Простейшим является метод освобождения сывороток от термостабильных неспецифических ингибиторов вирусов с помощью С02. Для этого сыворотку раз-
водят дистиллированной водой 1:10 и пропускают через нее С02 (из баллона или аппарата Киппа через тонкую трубку), так чтобы газ пузырьками проходил через жидкость в течение 3-5 мин (пока сыворотка не помутнеет). Затем сыворотку цен-
трифугируют 10-20 мин при 20002500 мин-1 и собирают надосадочную жидкость
(ингибиторы уходят в осадок). Для восстановления изотонии к сыворотке добав-
ляют 8,5 % хлористый натрий в объеме, равном 0,1 объема разведенной водой сы-
воротки. При использовании обработанной С02 сыворотки надо помнить, что она уже разведена 1:11.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
Сущность РНГА: эритроциты, на которых предварительно адсорбированы
антигены, приобре-
тают способность агглютинироваться в присутствии го-
мологичных сыво-
роток (антител).
Этот феномен по-
ложен в основу ме-
тода обнаружения
и титрования антител.
Рисунок 30 - Схема РНГА.
Эритроциты при этом
102
выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген - антитело и регистрируется визуально по характеру сформированного осадка (рисунок 30).
Следует отличать РНГА от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются в ре-
зультате взаимодейст-
вия их рецепторов с ре-
цепторами вирусов (ри-
сунок 31), а в РНГА -
комплексом антиген +
антитело.
Эритроциты, к по-
верхности которых
Рисунок 31 - Схема РГА.
прочно присоединены ан-
тигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом или эрит-
роцитами, сенсибилизированными антигеном. Эритроциты, к поверхности ко-
торых прочно присоединены антитела, называют эритроцитарным антитель-
ным диагностикумом или эритроцитами, сенсибилизированными антитела-
ми.
В качестве носителей (адсорбентов) антигенов или антител могут применять-
ся не только эритроциты, но и частицы целлюлозы, бентонита, латекса и др. До-
вольно широко используют латекс вследствие его стандартности и технологично-
сти изготовления диагностикума (проводят только стадию сенсибилизации).
Методика постановки РНГА включает:
а) приготовление сенсибилизированных эритроцитов (подготовка эритроци-
тов, их фиксация, танизация и сенсибилизация);
б) постановку главного опыта РНГА. Обычно в ветеринарных лабораториях ставят только главный опыт, а сенсибилизированные эритроциты готовят на предприятиях биологической промышленности.
Процесс приготовления эритроцитарного диагностикума:
1. Подготовка эритроцитов. Для этой цели широко применяют эритроциты
103
барана и человека, птиц (кур, индеек, уток); приготовленные на них диагностику-
мы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общеприня-
тым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим рас-
твором хлорида натрия при центрифугировании;
2. Фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в сус-
пензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего исполь-
зуют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны: 50 % взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50 % формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодиче-
ским встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (рН 7,2);
3. Танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты мало-
изучен. Однако при этом достигается главное - танизированные эритроциты обла-
дают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формали-
низированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3 % взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10-15-минутного кон-
такта при 37 °С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфат-
ным буфером (рН 7,2);
4. Сенсибилизация эритроцитов. 10 % концентрацию эритроцитов на 0,15 М
фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2-3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1 % концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содер-
жащем 1 % нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов).
Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА.
Главный опыт РНГА . Реакцию ставят в пробирках или в лунках плекси-
гласовых панелей (рисунок 32). РНГА ставят микрометодом, используя автомати-
104
ческие пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рисунок 33).
Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.
Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физраствором с рН 7,2-7,4, содержащим 1 % нор-
мальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки до-
бавляют по 0,2 мл сенсибилизирован-
ных антигеном эритроцитов.
Смесь встряхивают и выдер-
живают при комнатной темпера- |
Рисунок 32 - Плексигласовые панели. |
|
|
||
туре. Учет проводят через 2-3 ч по осаждению эритроцитов в контроле. |
||
Опыт сопровождают следующими контролями: |
||
1) на спонтанную гемагг- |
|
|
лютинацию |
эритроцитарного |
|
антигена |
(сенсибилизиро- |
|
ванные эритроциты + физрас-
твор с 1 % кроличьей сыворот-
ки);
2) на активность сенсиби-
лизированных эритроцитов
(сенсибилизированные эрит-
роциты + положительная сы-
воротка);
Рисунок 33 - Автоматические многоканальные
3) на специфичность сен- пипетки. сибилизированных эритроцитов
(сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомо-
логичная для данного антигена сыворотка); 4) на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуе-
мые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).
Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале:
105
+++ - перевернутый «зонтик» с неровными краями;
++ - по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;
+ - по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;
(-) - эритроциты оседают на дно в виде диска (колечка) - отрицательный ре-
зультат.
При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной - оседают в ви-
де компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсиби-
лизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сыво-
роткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.
За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, кото-
рое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.
РНГА позволяет решать задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизиро-
ванные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техни-
ки постановки и быстрота ответа (через 2-3 ч).
Недостатки: трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных ди-
агностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.)
Перечень контрольных вопросов:
1.Принцип РТГА.
2.Модификации РТГА.
3.Постановка РТГА.
106
4.Задачи РТГА.
5.Учет результатов РТГА.
6.Достоинства и недостатки РТГА.
7.Принцип РНГА.
8.Постановка РНГА.
9.Задачи РНГА.
10.Учет результатов РНГА.
11.Достоинства и недостатки РНГА.
Тема 1.10. Метод флуоресцирующих антител (МФА)
Цель: изучить принцип действия и способ постановки метода флуоресци-
рующих антител.
Содержание:
принцип МФА;
задачи, которые можно решить с помощью МФА;
принцип работы люминесцентного микроскопа;
флуорохромирование;
прямой РИФ;
непрямой РИФ.
Многие вещества живых организмов обладают собственной флуоресценцией
(свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекра-
щающееся сразу (от 10-9 до 10-7 с) после его окончания), но интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и использующиеся для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы (флуоресцирующие красители).
Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии исполь-
зуют ближнюю ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра. Люми-
несцентная микроскопия осуществляется с помощью специальных микроскопов.
107
Рисунок 34 - Люминесцентный микроскоп.
В люминесцентном микроскопе (рисунок 34) используют систему свето-
фильтров для выделения сине-фиолетовой части спектра (ФС-1, СС-4 + СС-8), те-
плозащитные фильтры для предохранения оптики от перегревания и выцветания препаратов (СЗС-14, СЗС-7, БС-8, кювет с водой или раствором медного купоро-
са) и запирающий фильтр на окуляре для снятия возбуждающего света и про-
пускания света люминесценции (ЖС-18, ЖС-3). Люминесцентный микроскоп ус-
танавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создаст помехи, что особенно сказывается при микрофотогра-
фировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вред-
ные газы от источника света. Лампа достигает полной силы света через 5-10 мин после включения, если сила тока при работе равна 4-5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения.
Большинство исследователей проводят люминесцентную микроскопию пре-
паратов в падающем свете, поскольку он имеет ряд преимуществ перед освеще-
нием препарата снизу: наименьшая потеря света, идущего от источника света,
108
лучший спектральный состав возбуждающего света, незначительное попадание прямого света в глаза исследователя и увеличение освещенности объектов.
При люминесцентной микроскопии используют нефлуоресцирующее иммер-
сионное масло высокого качества. Иногда применяют его заменитель - диметил-
фталат, длительное использование которого может привести к порче объективов.
В вирусологии люминесцентную микроскопию используют в двух основных методах: флуорохромировании и МФА.
Флуорохромирование - это обработка препарата флуорохромом с целью уве-
личения силы и контрастности свечения препарата.
Выпускаются специальные наборы флуорохромов. Наиболее широко приме-
няется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиози-
ловая группа (примулин). Флуорохром чаще всего используют в водных раство-
рах очень низкой концентрации (1:1000-1:1000000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна,
аденовирусах и др.).
Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызы-
вает полихроматическую флуоресценцию НК. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК - рубино-
во-красным.
Препараты для флуорохромирования готовят двумя способами:
а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек)
или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора
(1:10000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготов-
ленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) пре-
парат рассматривают в люминесцентном микроскопе;
б) мазки-отпечатки, полученные из патматериала, или инфицированные КК
(на покровных стеклах) фиксируют 96 ° этиловым спиртом в течение 15-30 мин,
промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридино-
вого оранжевого (1:10000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и ис-
следуют.
109
В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изум-
рудно-зеленое свечение, РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветом. В препаратах ДНК-содержащих вирусов (аденовирусов), ви-
русный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различной вели-
чины. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса (грипп), вирусный ма-
териал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.
Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное),
применяют обработку препаратов 0,5 % раствором РНК-азы или ДНК-азы в тече-
ние 5-10 мин или облучение УФ-лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин. Это слу-
жит доказательством специфичности вирусных НК.
Метод простого флуорохромирования несложен, но он не дает возможности полно дифференцировать возбудителей болезней.
МФА, или реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Принцип: антитела, со-
единенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело об-
наруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению бла-
годаря присутствию в нем флуорохрома. Таким образом, с помощью МФА реализу-
ется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, при-
чем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью.
Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные проти-
вовирусные сыворотки, максимально освобожденные от гетероантител. Из таких сывороток выделяют гомогенные фракции, содержащие антитела, которые метят флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ -
флуоресцеина изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамина сульфохлорид
(красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.
Хранить их рекомендуется при температуре минус 20 °С или при более низких температурах в герметически закрытых сосудах. Можно также консервировать конъюгат путем добавления тиомерсала 1:10000 и хранить при температуре 4°С.
110