ских исследований; термостатная комната; автоклавная для обеззараживания.

Пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом

- пластиком или линолеумом, а стены покрывают кафельной плиткой или окра-

шивают в светлые тона масляной краской. Окна и двери помещений «заразной» зоны лаборатории должны быть герметичными. На окна цокольного и первого этажей следует устанавливать металлические решетки, не нарушающие правил пожарной безопасности.

Основное рабочее помещение оборудуют лабораторными столами, шкафами и полками для хранения аппаратуры, посуды и реактивов. Лабораторная мебель в

«заразной» зоне должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и де-

зинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

Большое значение имеют боксы биологической безопасности (БББ), обеспе-

чивающие защиту персонала, материалов и окружающей среды лаборатории. В

них проводят всю лабораторную работу, связанную с посевом микроорганизмов и изучением их свойств, а также работу с животными (заражение, вскрытие), со-

держание инфицированных животных, центрифугирование патогенных биологи-

ческих агентов, сушку, дезинтеграцию, другие операции с вероятным об-

разованием аэрозоля, заражение культуры клеток и куриных эмбрионов, приго-

товление суспензий.

В БББ не должно быть не одного лишнего предмета. Столы в БББ оборудуют металлическими нержавеющими крышками для легкости стерилизации, а также газовыми горелками и обеспечивают подводку электроэнергии.

Вход в БББ устраивают через шлюз с раздвижной дверью - предбоксник, это исключает резкое перемещение воздуха.

В зависимости от степени биологической опасности различается три типа боксов:

- БББ I класса - предназначены для проведения стандартных микробиологи-

ческих исследований с микроорганизмами низкого и среднего классов опасности

(оборудованы системой отрицательного давления воздуха - преобладание притока над вытяжкой и системой вентиляции);

11

- БББ II класса - предназначены для выполнения микробиологических проце-

дур, требующих 2-го или 3-го уровня биобезопасности (оборудованы вертикаль-

ной системой потока воздуха со встроенными высокоэффективными сухими воз-

душными фильтрами, обеспечивающими защиту от внешней контаминации мате-

риалов, с которыми осуществляются манипуляции в БББ);

- БББ III - предназначены для проведения манипуляций, требующих 3-го и 4-

го уровня биобезопасности (полностью изолированные газонепроницаемые ком-

наты, обеспечивающие максимально возможный уровень защиты персонала и ок-

ружающей среды, необходимо использование средств индивидуальной защиты персонала).

Лабораторию обеспечивают холодной и горячей водой и вентиляцией с по-

дачей стерильного воздуха. Для регистрации поступающего патологического ма-

териала есть приемная, где несколько столов, обитых оцинкованной жестью, и

емкости с дезрастворами (3 %-ным хлорамина, или 5 %-ным фенола). В комнате для предварительной обработки материала вскрывают трупы и отбирают мате-

риал для дальнейшего исследования. Выполняют это на специальном столе.

Должны быть сосуды с дезрастворами, стеклянный шкаф для инструментария и стерильная посуда для сбора материала, а также шкаф для спецодежды. В боксе для получения культур клеток работать с вируссодержащим материалом запреща-

ется. В автоклавной стерилизуют посуду, питательные среды, аппаратуру, прибо-

ры и обезвреживают инфекционный материал. Необходимо иметь 2 автоклава -

для чистых и для инфицированных материалов; бак для сбора инфицированного материала, сушильные шкафы, дистилляторы и шкафы для стерильной посуды.

Моечная для мытья посуды, аппаратуры и приборов. Посуду, пипетки и инстру-

менты, загрязненные инфицированным материалом, моют после обезвреживания.

Виварий имеет комнаты для здоровых и экспериментальных животных, для мытья и дезинфекции клеток, для инвентаря и спецодежды, для приготовления кормов,

кладовую, фуражную, трупосжигательную печь и др. Лабораторные животные содержатся в клетках. На каждой клетке вывешивают паспорт, где отмечают дату поступления в виварий, массу. В паспорте на клетках с подопытными животными

12

дополнительно отмечают дату заражения и вид вируссодержащего материала, но-

мер экспертизы и число зараженных животных. Должен быть настольный бокс или лучше бокс с ламинарной подачей воздуха.

Требования: 1) обеспечить безопасность сотрудников; 2) предупредить кон-

таминацию исследуемого материала микрофлорой; 3) предупредить вынос ин-

фекции за пределы лаборатории.

Основные правила работы в лаборатории:

1.Вход в помещения посторонних лиц, и сотрудников без халата и сменной обуви запрещен;

2.Запрещено выходить за пределы лаборатории в халатах и спецобуви или надевать верхнюю одежду на халат, курить, принимать пищу в производственных помещениях и хранить в них продукты питания. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, при необходимости надевают резиновые перчатки и очки.

Обязательно меняют обувь;

3. Весь материал, поступающий в лабораторию на исследование, должен рассматриваться как инфицированный. Рабочее место на столе покрывают слоем марли, увлажненной 5 % раствором хлорамина. Инструменты, бывшие в употреб-

лении, обеззараживают, погружая в 5 % раствор хлорамина, фенола, лизола или серной кислоты;

4. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и тщательно де-

зинфицируют. Патматериал ставят на хранение в холодильник и опечатывают; 5. Очень важное значение имеет тщательная и прочная маркировка посуды,

содержащей инфекционный материал.

Пути заражения лабораторными инфекциями Аэрогенный - при смешивании, встряхивании, растирании, перемешивании

биологически опасного материала, а также при обжиге микробиологической пет-

ли возможно образование микробных аэрозолей. Поэтому помимо микроорганиз-

мов, передающихся аэрогенно (М. tuberculosis), в лаборатории аэрогенным путем могут распространяться микроорганизмы, для которых этот путь инфицирования не является естественным.

13

Для предотвращения образования опасных аэрозолей используется дополни-

тельное оборудование, такое как крышки безопасности на центрифугах, предот-

вращающие попадание микроорганизмов в окружающую среду при центрифуги-

ровании.

Алиментарный - попадание патогенных агентов через пищеварительную сис-

тему. Происходит в случае несоблюдения гигиенических норм на рабочем месте:

прием пищи, курение, недостаточная обработка рук перед едой, пипетирование ртом, неосознанные действия, приводящие к контакту рук со ртом (обкусывание ногтей), попадание контаминированных предметов (карандашей).

Контактный - попадание брызг биологически опасной суспензии на слизи-

стые оболочки глаз, носа и рта, прикосновение контаминированных рук к лицу может приводить к инфицированию.

Парэнтеральный - инокуляция инфицированного материала в результате случайного прокола иглой, пореза лезвием или осколками разбитой стеклянной посуды.

Уровни биологической безопасности

Уровни биологической безопасности (УББ) описываются сводом правил, в

зависимости от групп патогенности лабораторных инфекций. Они описывают оборудование для безопасного хранения биологического материала и необходи-

мые мероприятия, которые должен выполнять персонал лабораторий.

- УББ-1: минимальный уровень микробиологической безопасности - полно-

стью соответствует стандартным правилам работы в лаборатории. Рекомендован для работы с микроорганизмами, которые не вызывают развитие инфекций у здо-

ровых, такими как, например, Bacillus subtilis.

- УББ-2: используется при работе с вызывающими развитие инфекций раз-

личной степени тяжести у человека (Salmonella spp.). При выполнении стандарт-

ных микробиологических процедур с этими возбудителями можно работать на открытых лабораторных столах, особенно если используются первичные барьеры,

такие как защитная маска, халат и перчатки. Возможно использование боксов биологической безопасности и безопасной центрифуги.

14

- УББ-3: используется для безопасной работы с опасными микроорганизма-

ми, обычно передающимися аэрогенным путем, такими как М. tuberculosis и

Сoxiella burnetii. Предполагает строгое выполнение рекомендаций и наличие обо-

рудования первого и второго класса безопасности, включая особые требования к оснащению лаборатории, такие как, например, соответствующая система венти-

ляции. Работа со всеми микроорганизмами, относящимися к УББ-3, должна осу-

ществляться в боксах биологической безопасности.

- УББ-4: используется для работы с микроорганизмами, которые вызывают угрожающие жизни или неподдающиеся лечению инфекции, передающиеся пре-

имущественно аэрогенным путем (например, вирусы геморрагических лихора-

док). Работа с этими микроорганизмами проводится в боксах биологической безопасности III класса или персоналом, одетым в защитные костюмы, полностью закрывающие тело, с автономной подачей кислорода и положительным давле-

нием воздуха. Производственное оборудование полностью изолировано от других лабораторий и оснащено специальными системами вентиляции и уничтожения отходов.

Правила работы с вируссодержащим материалом и техника безо-

пасности:

1.Необходимо быть очень внимательным, собранным и аккуратным;

2.Входить в помещение лаборатории и выходить из него только в халате, пе-

реодеваясь в гардеробе;

3.Работать только в халате с застегнутыми манжетами, шапочке и марлевой

маске;

4.В лаборатории соблюдать чистоту и порядок. Нельзя курить и есть;

5.Материалы и инструменты для работы дежурный получает у лаборанта кафедры и раздает студентам;

6.Пользоваться только стерильными инструментами и посудой;

7.Открывать и закрывать сосуды (пробирки, флаконы, чашки и т.п.) у пла-

мени горелки;

8. Не брать пипеток в рот;

15

9.Отработанные инструменты, включая шприцы, складывать в стерилизатор для обезвреживания и кипячения;

10.Отработанные пипетки в сосуд с дезраствором;

11.Твердые и жидкие отходы (вата, бумага и т.д.) собирать в специальные контейнеры для последующей стерилизации;

12.Запрещается выливать или сбрасывать отходы в унитазы и раковины;

13.Если студент случайно разольет вируссодержащий материал, обязан не-

медленно сообщить об этом преподавателю и вместе с ним обеззаразить рабочее место;

14. В конце занятия привести в порядок свое рабочее место.

Правила безопасного поведения в «заразной» зоне

ветеринарной лаборатории

Необходимо:

1. проводить тщательную обработку рук перед началом работы и после окон-

чания; 2. работать в медицинских халатах, пижамах (комбинезонах), шапочках,

сменной обуви и пользоваться средствами индивидуальной защиты в зависимости от характера выполняемых работ;

3. обратить особое внимание на использование, условия хранения и уничто-

жение отработанных игл и других острых предметов - они должны уничтожаться

вспециальных контейнерах для того, чтобы уменьшить риск травмы;

4.при проведении работ с биологически опасным материалом использовать латексные перчатки подходящего размера;

5.использовать маски и защитные очки при вскрытии трупов животных, ко-

гда имеется высокая вероятность случайного контакта с кровью и биологически-

ми жидкостями животного; 6. дезинфицировать рабочие поверхности ежедневно и при случайном попа-

дании биологического материала, использовать дезинфектанты с бактерицидным действием;

16

7.потенциально инфицированные отходы хранить отдельно и уничтожать их

впрочных маркированных мешках для биологически опасного материала.

Запрещается:

1.хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику и т.п., а также продукты питания;

2.принимать пищу, пить, жевать жевательную резинку и курить в лаборато-

рии;

3.хранить продукты в холодильных камерах, используемых для хранения клинического материала;

4.проводить пипетирование ртом, переливать жидкий инфекционный мате-

риал через край сосуда (пробирки, колбы, флакона и др.); 5. удалять необеззараженные сгустки крови из пробирок, флаконов вытряхи-

ванием; 6. оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого вида ра-

бот с патогенным биологическим агентом;

7.оставлять после окончания работы на рабочих местах нефиксированные мазки или посуду с патогенным биологическим агентом;

8.сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый матери-

ал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания.

Учёт, хранение и этикетирование вирусного сырья в лаборатории.

Вируссодержащие материалы в пробирках и других сосудах должны быть снабжены этикеткой, где указаны вирус, штамм, дата получения, номер пассажа,

объем и другие сведения. Данные этикеток должны полностью соответствовать записям в журнале штаммов лаборатории. Штаммы вирусов хранят в холодиль-

нике под замком с пломбой или печатью. Вирусы выделенных штаммов, как и стандартных, необходимых для сравнения и серологических исследований, следу-

ет хранить в условиях, обеспечивающих их максимально длительную жизнеспо-

собность.

Консервация вирусов:

17

1. При хранении вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50 % раствор на физрастворе), обладающий бактериоста-

тическим действием и в то же время защищает вирусы. В этом случае вирус мож-

но хранить при 4 °С несколько месяцев; 2. Вирусы хранят в холодильниках при -20, -30, -70 °С. При этой температуре

некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка одного из следующих компонентов: инактивирован-

ной сыворотки крови, обезжиренного молока (от 10 до 30 %), желатина (0,5-1,5

%), ДМСО (10 %) и др. При быстром замораживании вируса до -196 °С (жидкий азот) с последующим хранением при этой температуре титр вируса в течение не-

скольких месяцев не снижается. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН,

следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов

(NaН2PО4 или КН2РО4), обладают кислой реакцией и имеют более низкую точку замерзания, чем двузамещенные фосфаты (Na2HP04 или К2НРО4) с щелочной ре-

акцией. Скорость оттаивания вируса существенно не влияет на его активность.

Размораживать вирусы можно как при комнатной температуре, так и в водяной бане при температуре 37°С. Необходимо хранить маленькими порциями, доста-

точными для одноразового титрования или использования.

3. Лиофилизация, т.е. высушивание в замороженном состоянии в условиях вакуума - хороший способ консервирования вирусов. На стойкость лиофилизиро-

ванного вируса влияет не только выбор соответствующего наполнителя, но и со-

став газа в ампуле (уже 0,5 % кислорода вызывают быструю гибель вируса, в то время как влажность в границах 2-3 % существенно не влияет) и температура хранения лиофилизата - не выше 4 °С. Лиофилизированные вирусы могут хра-

ниться несколько лет.

Документирование проводимых исследований В ходе проводимых исследований необходимо обязательно фиксировать

промежуточные и конечный результаты.

18

Основным документом является прошнурованный, пронумерованный и опечатанный рабочий лабораторный журнал. Записи производят аккуратно, четко в заранее определенном неизменном порядке.

Вирусологическая лаборатория должна иметь следующую документацию:

1.Журнал вирусологических исследований (экспертиз, сельхозучета, формы

№13-вет);

2.Журнал учета зараженных животных;

3.Журнал учета выделенных вирусов и их уничтожения;

4.Журнал учета движения производственных или музейных штаммов и другие книги учета согласно утвержденной инструкции.

Правила и методы получения

и транспортировки вируссодержащего материала

от больных животных и трупов

Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно скорее после появления ярких признаков болезни или не позднее 2-3 ч после клинической смерти или убоя, т.к. в первые 1-2

дня значительно ослабевает барьерная роль кишечника и способствует рассеиванию кишечной флоры - в трупе быстро развивается бактериальное обсеменение, взять пробу стерильно становится невозможно; и в результате воздействия защитных механизмов организма количество вируса может уменьшаться, может наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть не обнаружен или его количество окажется столь незначительным, что обычными рутинными методами исследования выделить его не удается.

При взятии патматериала исходят из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения и пути выделения). При респираторных инфекциях берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных - кал; при нейротропных - кусочки головного или спинного мозга; при дермотропных инфекциях - свежие поражения кожи и т.п., т.е. отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом

19

для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки ор-

ганов, кровь, лимфа и пр.

Кровь берут из яремной вены, у свиней - из кончика хвоста или уха. Лучше кровь у свиней брать из орбитального венозного сплетения. Иглу вводят в область наружного угла глаза под углом 45 °С и направляют к противоположному углу нижней челюсти. Иглу вводят до упора в орбиту, если кровь не идет, то иглу можно отвести. Используют цельную дефибринированную, либо «лаковую» кровь

(кровь с дистиллированной водой (1:1), либо отдельные элементы крови (эритро-

циты, лейкоциты, плазма, сыворотка). Для обнаружения противовирусных анти-

тел кровь берут дважды с интервалом 2-3 недели для получения парных сыворо-

ток.

Смывы с конъюнктивы, со слизистой оболочки носа, с задней стенки глотки,

прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погру-

жают в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответст-

вующей жидкости (раствор Хенкса, среды для КК (199, Игла) с антибиотиками

(пенициллин и стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1 мл среды) и

белковым стабилизатором - для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов).

Мокроту собирают при помощи трахеотомии – в трахею вставляют трахео-

тубус, вводят через него металлическую трубочку с шелковой кисточкой на кон-

це. Рефлекторно происходит кашель и мокрота остается на кисточке. Ее помеща-

ют в пробирку.

Слюну (при подозрении на поражения ротовой полости или слюнных желез)

собирают прямо в пробирку - пропитывают слюной стерильный тампон из ваты на палочке и помещают в пробирку с небольшим количеством физраствора, за-

крывают резиновой пробкой.

Мочу собирают при помощи катетера в стерильную посуду.

Фекалии берут из прямой кишки шпателем или палочкой и помещают в сте-

рильную пробирку.

20