- •1.Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.
- •3.Антиидиотипические и видоспецифические антитела
- •5. Мка получают с помощью гибридомной технологии, а пка выделяют из сыворотки.
- •6. Методы получения антител
- •7. Стадии получения мка и пка
- •9 Требования к свойствам моноклональных антител:
- •10 Вопрос. Гибридомная технология.
- •12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.
- •13 .Селекция методом фагового дисплея.
- •In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
- •Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.
- •Типы наночастиц
- •17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
- •18. Классификация методов на основе антител
- •19. Прямые и непрямые иммунохимические методы
- •21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
- •23. Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело
- •26)Радиоиммунологические методы.
- •27. Виды ифа. Чувствительность анализа, способы её повышения.
- •29. Ифа. Принцип. Конкурентный и «Сэндвич»-ифа.
- •31. Твердофазные виды ифа. Подбор условий методом «шахматной доски»
- •32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
- •33.Метод иммунного блоттинга
- •34.Клеточный ифа. EliSpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (пфиа).
- •36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.
- •37. Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.
- •38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации
- •40. Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.
- •42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
- •43. Фагоциты: исследование функций
- •5. Комплемент, лабораторное исследование функций
- •Иммунные комплексы циркулирующие: методы определения
- •45. Методы выявления клеточных антигенов. Маркеры клеточной активации. Дифференцировочные маркеры лейкоцитов.
- •46.Иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокорекция, иммуномодуляция. Выбор средств, определение вида и способа иммунокорекции.
- •1. Основные виды иммунокорригирующей терапии
- •2. Выбор средств, определение вида и способа иммунокоррекции
- •48. Оценка фагоцитоза, в- и т-систем иммунитета, активности антителобразующих клеток.
- •49)Иммунопроилактика. Вакцины. Виды вакцин. Способы их получения. Успехи применения вакцинации.
- •50)Иммунодифициты: диагностика и иммунотерапия. Оценка иммунного статуса прииммуннодифицитах.
- •51. Стимуляция пролиферации дендритных клеток. Содействие захвату антигена и его процессингу. Стимуляция ответа эффекторных клеток при помощи прямой презентации антигена.
- •52)Направления имуннотерапии рака. Противораковые вакцины.
- •53.Применение имитаторов опухолевых антигенов. Экстрокорпоральная активация противораковых иммунокомпетентных клеток
- •54.Элиминация раковой опухоли с помощью антител. Ангиостатический подход. Использование цитокинов
- •55. Пробиотики, пищевые волокна.
- •56. Применение иммуномодуляторов при иммунодефицитах.
- •59. Критерии выбора методов для исследования, их применение в биологии, экспериментальной и практической медицине и др. Областях
- •60. Иммунологические подходы и методы, применяемые в медицине
17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
Трансгенные организмы – это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Трансген – это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных животных
Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных.
Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном индивидуумов можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгенеза:
метод микроинъекции
опосредованный ретровирусами перенос генов
перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток
перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.
Наиболее широко используемым методом трансгенеза в животноводстве является метод микроинъекции, суть которого заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот.
Результативным способом переноса ДНК в эмбриональные линии животных является применение так называемых ретровирусных векторов.
Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как полипотентные стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Еще один способ получения трансгенных животных является перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом. Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрссируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы слишком велики для встраивания в обычные векторы.
Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примечательный пример трансгеноза с помощью YAC. Моноклональные антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человеческие моноклональные антитела практически невозможно.
Первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в России в 1987 году: Эрнст Л.К. с соавторами [1987] сообщили о создании трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Год спустя были созданы кролики с интеграцией генов соматотропина человека, антисмысловой РНК против аденовируса Adh5.
Исследования проводятся российскими учеными в двух основных направлениях: разработка и совершенствование способов и приемов введения экзогенной ДНК в эмбриональные и соматические клетки сельскохозяйственных животных и использование существующих технологий для создания трансгенных сельскохозяйственных животных для медицины, ветеринарии и других потребностей человека.
Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях.
Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных.
В клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными.
Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перенесены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков. Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. Были разработаны методы прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции, электропорация и методы биобаллистики. В этом случае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструкции с целевыми генами.
Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные ткани. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена. Продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений.
Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях успешно синтезированы разные их производные: Fab-фрагменты, одноцепочечные вариабельные фрагменты, биспецифичные вариабельные фрагменты.
Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои.
Моноклональные антитела, экспрессированные в сое – антитела против генитального герпеса, могут также быть внедрены в производство. Эти антитела, несмотря на различие в гликозилировании, защищали мышей от вируса герпеса типа 2 так же хорошо, как и антитела, синтезированные в культуре клеток человека. Еще одни антитела, прошедшие фазу I клинических испытаний – scFv-антитела против лимфомы.
Трансгенные растения рассматриваются как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов для медицинских и исследовательских целей.