12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.

Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты получают в результате экспрессии иммуноглобулиновых генов, соединенных с генами токсинов или ферментов. В зависимости от размера фрагмента иммуноглобулинового гена различают, например, sc-Fv-токсин или Fab-токсин. Основные достоинства – воспроизводимость и биотехнологичность препаратов (в отличие от традиционных коньюгатов), а также значительно меньший размер получаемых молекул, что является принципиальным для использования в случае ряда заболеваний.

Иммуноадгезины (immunoadhesins) обычно состоят из Fc-фрагмента молекулы антитела и лиганда, специфичного к определенному рецептору, например CD4 . Такая молекула за счет CD4-фрагмента будет связываться с белком gp120 на поверхности клеток, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, и за счет Fc-фрагмента вызывать их уничтожение посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности или действия системы комплемента.

Абзимы -- (antibody + enzyme) – каталитически активные антитела, способные не только распознавать и связывать определенный антиген, но и катализировать гиалуронидазную, оксидоредуктазную, протеазную, нуклеазную (ДНК- и РНК-азную), протеинкиназную реакции (обладающие свойствами ферментов). Уровень абзимов возрастает в процессе иммунизации организма, при ряде патологических состояний (аутоиммунных, воспалительных), что может указывать на их патогенетическую роль при заболеваниях. При катализе используется энергия сайт-специфического связывания А. с молекулой-мишенью.

Природные и искусственные абзимы.

Абзимы, как правило, представляют собой искусственные моноклональные антитела.

Природные абзимы выделены из крови пациентов с различными аутоиммунными (системная красная волчанка, аутоиммунный тиреоидит, рассеянный склероз, астма, СПИД) инфекционными (вирусными, бактериальными) заболеваниями, а также из крови и молока здоровых по медицинским показаниям рожениц.

Показаны два основных механизма происхождения каталитических активностей антител. Согласно первому механизму, активные центры антител могут имитировать переходные состояния соответствующих химических реакций. По второму механизму, называемому «антиидиотипической сетью Эрне», активные центры антител представляют собой антиидиотипы активных центров других антител (которые в таком случае являются антигенами). Показано образование антиидиотипических антител до седьмого порядка.

13 .Селекция методом фагового дисплея.

Метод фагового дисплея применяется для изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий, а также для выявления участков, ответственных за эти взаимодействия. Он основан на использовании бактериофагов для соотнесения генов и кодируемых ими белков. При этом в оболочке фага оказывается представленной (displayed) белковая молекула, информация о которой содержится в рекомбинантной ДНК этого бактериофага. Для конструирования рекомбинантной ДНК наилучшим образом подходят нитевидные фаги M13, fd и f1.

Основной белок оболочки нитевидного бактериофага – рVIII – формирует цилиндр вокруг молекулы ДНК. Верхняя часть цилиндра закрыта белками рVII и pIX. Противоположный конец закрывается пятью молекулами белков рVI и рIII, которые обеспечивают адсорбцию фагов на половых ворсинках бактериальных клеток.

В ходе репликации фагового генома в бактериальной клетке происходит накопление двунитевых репликативных форм. Когда их число становится 100-200 молекул на клетку дальнейшее их образование прекращается, так как кольцевые одноцепочечные нити ДНК фага покрываются фаговым SSB-белком pV. Однонитевые ДНК направляются в периплазматическое пространство и упаковываются там в фаговые белки оболочки - рIII и рVIII – которые находятся во внутренней мембране.

При построении клонотек на основе фагового дисплея в геном нитевидного фага встраивают чужеродный ген, кодирующий синтез определенного белка или пептида (селективного маркера), который после синтеза оказывается представленным в оболочке фага.

Помимо нитевидных бактериофагов в фаговом дисплее могут использоваться и другие колифаги - λ и Т4.

Создание клонотек пептидов методом фагового дисплея

Метод фагового дисплея представляет собой простую и эффективную систему отбора белков и пептидов с требуемыми свойствами, экспрессированных на поверхности частиц нитевидных бактериофагов. Данный метод обеспечивает прослеживание прямой зависимости между фенотипом и генотипом. Разработан эффективный метод наработки коротких пептидов, экспрессирующихся на поверхности бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Фаг, несущий рекомбинантную ДНК, внедряется в бактериальную клетку (E.coli), где происходит его амплификация. Таким образом создаются библиотеки, содержащие миллионы фагов, каждый из которых содержит в своем капсиде уникальный пептид.

Для конструирования клонотеки пептидов используют основной (pVIII) и минорный (pIII) белки оболочки нитевидного фага. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. Пептидные эпитопы связываются с N-концевыми последовательностями зрелых белков или на небольшом от них расстоянии. Поскольку концевые последовательности большинства белков, как правило, экспрессируются на поверхности глобулы, то интегрируемые пептиды не нарушают основных свойств белков pVIII и pIII, а также оказываются доступными для их распознавания извне