32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом:
- смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану;
- мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам.
Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции.
D
ot-blot:
упрощ. модель вестерна. Не надо разделение
электрофорезом.Dot-пятнышко.
Пятнышко с р-ром смеси белков. Испол.
если концентрация очень мала. Позволяет
сконцентрировать белок. Смотрим,
взаимодействует ли с а\т. Можно наносить
механически, а можно с помощью аппарата.
Есть панель с дырочками(96) на нее
мембрана на нее 96-луночная панель(лунки
соотв. дырочкам). В лунки загоняется
жидк. проходит вниз белки оседают
на мембрану.
Каждое пятнышко или полосочку можно разрезать на несколько частей, затем анализ.
Проявление при помощи ферментных способов(нер-римые субстраты), иммунофлюор. м-ды.
Амплификация сигнала 1.
Прямой (А) и непрямой (Б) метод визуализации результатов реакции «антиген-антитело»
Преимущества Б:
вторичные антитела против Fc-фрагмента другого вида животного получать намного проще, также легче присоединить к ним метку;
первичные антитела не несут на себе лишнего груза, а значит, легче и быстрее проникают в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.
Амплификация сигнала 2. - системы с использованием антител против пероксидазы и щелочной фосфатазы (PAP и APAAP-комплексы).
1 этап: первичные антитела
2 этап: вторичные антитела против первичных (связующее антитело)
3 этап: вносятся антитела против пероксидазы или щелочной фосфатазы, полученные от животного того же вида, от которого получены первичные антитела, антигенсвязывающие участки которого заняты соответствующим ферментом.
Формируется комплекс, где с одним антигеном связываются уже 2 молекулы фермента
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 3 - метод непрямого иммуноокрашивания с использованием биотин-авидинового комплекса (1979)
Биотин
- является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования).
- соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте.
- легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами.
- содержится в большом количестве в белках птичьих яиц, где он связан с авидином
Авидин
образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс: К(А)=10(15) моль(-1)
гликопротеид с молекулярной массой 68 кДа
имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 4 применение полимерных систем
Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 5 системы, основанные на применении тирамида
Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз.
Первые три этапа такие же, как в ABC-методе. Последующие этапы:
А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином;
Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело».
В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, связанным с тирамидом.
Детекция- визуальная оценка