- •1.Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.
- •3.Антиидиотипические и видоспецифические антитела
- •5. Мка получают с помощью гибридомной технологии, а пка выделяют из сыворотки.
- •6. Методы получения антител
- •7. Стадии получения мка и пка
- •9 Требования к свойствам моноклональных антител:
- •10 Вопрос. Гибридомная технология.
- •12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.
- •13 .Селекция методом фагового дисплея.
- •In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
- •Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.
- •Типы наночастиц
- •17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
- •18. Классификация методов на основе антител
- •19. Прямые и непрямые иммунохимические методы
- •21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
- •23. Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело
- •26)Радиоиммунологические методы.
- •27. Виды ифа. Чувствительность анализа, способы её повышения.
- •29. Ифа. Принцип. Конкурентный и «Сэндвич»-ифа.
- •31. Твердофазные виды ифа. Подбор условий методом «шахматной доски»
- •32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
- •33.Метод иммунного блоттинга
- •34.Клеточный ифа. EliSpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (пфиа).
- •36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.
- •37. Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.
- •38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации
- •40. Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.
- •42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
- •43. Фагоциты: исследование функций
- •5. Комплемент, лабораторное исследование функций
- •Иммунные комплексы циркулирующие: методы определения
- •45. Методы выявления клеточных антигенов. Маркеры клеточной активации. Дифференцировочные маркеры лейкоцитов.
- •46.Иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокорекция, иммуномодуляция. Выбор средств, определение вида и способа иммунокорекции.
- •1. Основные виды иммунокорригирующей терапии
- •2. Выбор средств, определение вида и способа иммунокоррекции
- •48. Оценка фагоцитоза, в- и т-систем иммунитета, активности антителобразующих клеток.
- •49)Иммунопроилактика. Вакцины. Виды вакцин. Способы их получения. Успехи применения вакцинации.
- •50)Иммунодифициты: диагностика и иммунотерапия. Оценка иммунного статуса прииммуннодифицитах.
- •51. Стимуляция пролиферации дендритных клеток. Содействие захвату антигена и его процессингу. Стимуляция ответа эффекторных клеток при помощи прямой презентации антигена.
- •52)Направления имуннотерапии рака. Противораковые вакцины.
- •53.Применение имитаторов опухолевых антигенов. Экстрокорпоральная активация противораковых иммунокомпетентных клеток
- •54.Элиминация раковой опухоли с помощью антител. Ангиостатический подход. Использование цитокинов
- •55. Пробиотики, пищевые волокна.
- •56. Применение иммуномодуляторов при иммунодефицитах.
- •59. Критерии выбора методов для исследования, их применение в биологии, экспериментальной и практической медицине и др. Областях
- •60. Иммунологические подходы и методы, применяемые в медицине
In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
Процесс распознавания пептидов называется in vitro селекцией, в ходе которой производят скрининг фаговых библиотек путем взаимодействия экспонированных на поверхности фагов белков с определенным иммобилизованным лигандом.
Для того чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. Для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (mAB) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина.
Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, связываются с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низким значением рН, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактриальных клетках, и экспрессированные на их поверхности эпитопы исследуют по различным критериям.
Многие высокодифференцированные ткани организма утрачивают свои специфические свойства в условиях культивирования in vitro. Поэтому отбор требуемых пептидов фагового дисплея осуществляют in vivo.
В этом случае суспензию фаговых частиц дисплея вводят в кровоток экспериментального животного, через некоторое время из исследуемого органа животного выделяют находящиеся там фаговые частицы. Выделенные фаги размножают в бактериальных клетках и проводят новый раунд отбора, в результате чего удается выделять фаговые частицы, специфически задерживаемые данным органом, а следовательно, экспрессирующие на своей поверхности лиганды, специфичные в отношении рецепторов органа.
Отбор in vivo пептидов и белков, экспрессирующихся в фаговом дисплее, может быть применен и для разработки новых лигандов белковой природы, специфичных в отношении других тканей, в том числе опухолевых, что может быть использовано для лечения соответствующих заболеваний.
Фаговый дисплей антител
Первыми белковыми молекулами, успешно «представленными» на поверхности нитевидных бактериофагов, были иммуноглобулины, а точнее их антигензсвязывающие фрагменты (scFv или Fab). Обычно после процедуры выделения и очистки Fab-фрагменты являются более стабильными по сравнению с scFv-фрагментами антител. Также из Fab-фрагментов сравнительно легко можно получить полноразмерные иммуноглобулины. Для этого к С-концевой части СН1-домена присоединяют Fc-фрагмент.
Технология фагового дисплея антител происходит следующим образом. В фагмиде (pCES1) конструируют ген, в котором последовательность, кодирующая вариабельный и первый константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH и СН1), объединяют в правильной рамке трансляциии с геном III нитевидного фага fd.
Вторая, дополняющая цепь Fab-фрагмента, состоящая из вариабельного и первого константного домена легкой цепи иммуноглобулина (VL и СL), экспрессируется отдельно. Сигнальная последовательность (S) направляет экспрессированные белки в периплазму бактериальной клетки. После секреции в периплазматическое пространство клетки обе цепи ассоциируют и образуют активный Fab-фрагмент иммуноглобулина.
14. Проблема решается с помощью метода «гуманизации» мышиных антител. Суть метода заключается в создании генетических структур, которые объединяют V-гены мышиных моноклональных антител и С-гены иммуноглобулина человека необходимого изотипа. В результате специфичность образующихся гибридных антител определяются генами мыши, а их антигенные свойства — преимущественно генами человека. Более сложный, но радикальный способ заключается в объединении гипервариабельных частей V-генов мыши с человеческими С-генами и генами, кодирующими каркасную последовательность V-гена.Методы «гуманизации» моноклональных антител открывают перспективу получения больших объемов моноклональных антител, которые могут использоваться для иммунотерапии самых разнообразных патологических состояний у человека.
Фьюжин-белки используют для иммунизации и для того чтобы а/т не деградировало в организме (пришивают БСА) и т.о. увеличивается продолжительность жизни а\т.
ПЕГ-антитела –полиэтиленгликоль пришивается к молекулам на свободные хвосты, расчепляющиеся протеазами крови,и фермент не могут сесть на свое место и а/т будет циркулировать. (сывороточный альбумин).