Будова лактозного оперону

Лактозний оперон містить lac-промотор, lac-оператор, структурні гени: β-галактозидази (z), пермеази (y), трансацетилази (а) (рис. 2). Оперон знаходиться під негативним контролем. Регуляторний білок зв’язаний з оператором і перешкоджає транскрипції, доки відсутній індуктор. Коли у середовищі з’являється індуктор – лактоза (алолактоза), він з’єднується з репресором, змінює його конформацію, і таким чином зменшує його спорідненість з ДНК. В результаті оперон звільнюється для транскрипції.

Будова триптофанового оперону

Триптофановий оперон складається з промотора, оператора і п’яти структурних генів. Структурні гени (А-Е) кодують ферменти, які приймають участь у біосинтезі триптофану – незамінної амінокислоти. Коли концентрація триптофану зростає, його синтез стає небажаним, і транскрипція припиняється. «Включення» транскрипції відбувається наступним чином. Триптофан зв’язується з димерним репресором (trp-репресором), який кодується окремими генами, що не входять у склад оперону. При цьому відбувається конформаційна зміна, і відкривається ділянка, здатна зв’язуватись з операторною послідовністю в ДНК. Весь комплекс зв’язується далі з ДНК і блокує місце зв’язування з РНК-полімеразою (промотор). Робота триптофанового оперону є прикладом регуляції експресії генів за допомогою репресії.

Рис. 3. Схематичне зображення роботи триптофанового оперона E.coli: А – продукт гена-регулятора (R) – неактивна форма репресора, нездатна зв’язуватися з оператором (О); промоторна ділянка (Р) відкрита; відбувається транскрипція структурних генів (E, D, C, B, A). Б – у присутності корепресора утворюється активний комплекс корепресор-реперсор, який зв’язується з оператором і закриває промотор; транскрипція не відбувається.

Позитивний контроль оперону і катаболітна репресія

Ми з вами розглянули приклади негативного контролю роботи оперонів. Деякі оперони функціонують тільки в присутності контролюючого фактора, тобто знаходяться під позитивним контролем.

Функція лак-оперону регулюється білком – катаболітним активатором (САР) або білком – репресором циклічної АМФ (CRP) і невеликим циклічним нуклеотидом 3’, 5’ – циклічним аденозинмонофосфатом (ц АМФ), так само, як і білком-репресором.

Лак – промотор містить САР сайт, до якого САР повинен приєднатись до того, як РНК-полімераза може прикріпитись до промотора і почати транскрипцію. САР-білок знатний приєднатися до САР-сайту тільки після того, як утворить комплекс з цАМФ. Ця система позитивного контролю робить активність лак-оперону залежною від цАМФ так само, як і від присутності лактози.

Значення цієї системи для бактерій показано на простому прикладі. Якщо E.coli росте на середовищі, що містить глюкозу і лактозу, вона спершу використовує глюкозу. Потім після короткої лаг-фази відновлюється ріст і в якості джерела вуглецю використовується лактоза.

Такий двохфазний ріст називається диауксичним. Частково він пояснюється катаболітною репресією. Ферменти для катаболізму глюкози конститутивні і не залежать від активності САР. Коли бактерія отримує глюкозу, рівень цАМФ падає, що призводить до дезактивації САР-білка та інгибування експресії лак-оперону.

Рис. 4. Крива росту E.coli за наявності у середовищі глюкози і лактози.

Атенюація (розведення) – механізм регуляції транскрипції генів у ряду бактерій. Є наслідком передчасної термінації синтезу мРНК у певній ділянці гену – атенюаторі.

Мікробіологам протягом багатьох років відомо, що експресія генів може контролюватись обома регуляторними білками (білком-репресором і САР), а також аміноацил-тРНК. Досить недавно було відкрито, що активність деяких генів контролюється спеціальним типом молекул – регуляторною РНК. Регуляторна РНК називається антисенс-РНК, вона має основну послідовність нуклеотидів, комплементарну сегменту іншої молекули РНК і специфічно зв’язується з РНК-мішенню. Зв’язуючись, антисенсна РНК, може блокувати реплікацію ДНК, синтез мРНК або трансляцію. Гени, які кодують такі РНК іноді називають антисенсними генами.

Ця модель регуляції широко розповсюджена серед вірусів і бактерій. Приклади: регуляція реплікації плазмід і Т10 транспозона, осморегуляція експресії порінових білків, регуляція репродукції λ-фага, авторегуляція синтезу білка-репресора цАМФ (САР). Регуляція антисенсною РНК поки що не знайдена в еукаріотних клітинах.

BOX

Регуляція антисенсною РНК Розглянемо регуляцію антисенсною РНК на прикладі плазміди Col E1 E.coli. Реплікація плазміди регулюється таким чином, що в клітині присутні 10-30 копій плазміди. РНК-І – антисенсна РНК довжиною приблизно 100 нуклеотидів, зв’язується з попередником РНК, який використовується для утворення РНК-праймера (затравки) в процесі реплікації плазмідної ДНК. ДНК-полімераза не може копіювати плазміну без праймера, і реплікація блокується. Таким чином, РНК-І контролює реплікацію ДНК шляхом регулювання кількості функціональних РНК-праймерів. Другий приклад контролю антисенсною РНК – регуляція синтезу поринів для зовнішньої мембрани E.coli. Зовнішня мембрана містить канали, утворені пориновими білками. Два найважливіших порини E.coli – це Omp F і Omp C білки. Omp C пори менші за розміром і утворюються, коли бактерія росте в середовищі з високим осмотичним тиском. Цей порин є домінантним для E.coli кишкового тракту. В цьому є сенс, оскільки менші пори не допускають проникнення багатьох токсичних молекул, присутніх в кишківнику. Більші Omp F пори дають перевагу тоді, коли E.coli росте в розведеному середовищі, вони дозволяють проникати розчинним речовинам у клітину швидше. Гени omp F і omp C частково регулюються спеціальним Omp R білком, який репресує гени omp F і активує omp C. Крім того, ген mic F утворює 174-нуклеотидну антисенсну mic F РНК, яка блокує роботу гена opm F. Mic РНК комплементарна послідовності нуклеотидів omp F в сайті ініціації трансляції. Вона утворює комплекс з omp F мРНК і репересує трансляцію. Гени mic F активуються при певних умовах, таких як високий осмотичний тиск, що робить переважним експресію omp C генів. У результаті такої регуляції білки Omp F і Omp C не можуть синтезуватись одночасно. Той факт, що антисенсна РНК може зв’язуватись специфічно з мРНК і блокувати її активність має велике практичне застосування. Антисенсна РНК є цінним інструментом у руках дослідників. Допустимо, треба вивчити функціонування певного гену. Антисенсну РНК, яка зв’яжеться з мРНК гену можна конструювати та ввести в клітину, таким чином блокуючи експресію цього гену, а потім спостерігати за змінами в клітині.

Антисенсні РНК і ДНК можуть бути ефективними проти раку та інфекційних захворювань. Були отримані попередні обнадійливі результати по застосуванню антисенсних олігонуклеотидів проти Tripanosoma brucei, яка викликає Африканську сплячу хворобу, герпесовірусів, ВІЛ-віруса, вірусів пухлин – RSV і вірусів поліоми та хронічної мієлогенної лейкемії.

РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ У ЕУКАРІОТ

Еукаріотичні організми в значній мірі представлені багатоклітинними формами зі значною спеціалізацією клітин. Хоч у всіх клітинах людини міститься абсолютно однакова ДНК, у різних тканинах відбувається експресія далеко не однакових наборів генів. Таким чином, є механізми, які регулюють експресію генів. У еукаріот існує регуляція на таких рівнях:

1. Регуляція на рівні транскрипції здійснюється на рівні синтезу мРНК. Середні концентрації індивідуальних мРНК з різних генів сильно відрізняються. Це обумовлено тим, наприклад, що мРНК-копії одних генів руйнуються швидше інших, або тим, що їх синтез відбувається повільніше. Регуляція може відбуватися за допомогою білків, здатних зв’язуватись з ДНК, а також за допомогою коротких фрагментів РНК, які зв’язуються з ДНК і блокують місця прикріплення РНК-полімерази. Таким чином швидкість транскрипції може знижуватись або підвищуватись.

2. Посттранкрипційна регуляція здійснюється на рівні процесінга мРНК. Навіть у тому випадку, якщо транскрипція двох різних генів проходить з однаковою швидкістю, подальший процесінг мРНК, який включає модифікацію 5’ і 3’-кінців і сплайсинг екзонів (екзони залишаються, інтрони вирізаються), може проходити по-різному у різних мРНК.

3. Регуляція на рівні трансляції здійснюється за рахунок того, що виключається можливість використання мРНК в якості матриці для синтезу білка, хоча вона і присутня в цитоплазмі. Наприклад, в ооциті морського їжака багато мРНК, але помітного синтезу білка не проходить, доки ооцит не буде запліднений. Лише після цього мРНК модифікується, тобто на 5’-кінці утворюється «шпилька» - сар, а на 3’-кінці приєднується шлейф з poly A. Тільки після цього вони можуть включатись у нормальний трансляційний процес, який завершується побудовою молекули білка.

4. Посттрансляційна регуляція базується на тому, що багато білків синтезуються в неактивній формі і повинні ще пройти стадію модифікації. Так, в β-клітинах підшлункової залози синтезується не інсулін як такий, а його попередник, який має довший поліпептидний ланцюг і додаткову послідовність амінокислотних залишків. Лише після того, як ця послідовність вирізається протеолітичним ферментом, утворюється власне функціональний гормон.

5. Регуляція за допомогою гормонів – це окремий випадок регуляції на рівні транскрипції, таким чином організм змушує клітини включати певні гени у відповідь на зовнішній стимул. Так стероїдні гормони з тих клітин, де вони були синтезовані, потрапляють в цитоплазму відповідних клітин-мішеней, звідки спеціальний транспортний білок переносить їх в ядро, де вони можуть активувати ті чи інші гени шляхом прямої взаємодії з хроматином у відповідних місцях. Кожен гормон активує свій набір генів.

ЛІТЕРАТУРА:

1. С.П.Гудзь, С.О.Гнатуш, І.С.Білінська. Мікробіологія: підручник:[для студ.вищ.навч.закл.]: Львів: Видав-ничий центр ЛНУ імені Івана Франка, 2009. – 359 с.

2. L.M.Prescott, J.P.Harley,D.A.Klein. Microbiology: Dublin, Melburn,Oxford, printed in the USA by Wm.C.Brown Communications,Inc., 3ed., 1996. – 935 p.

Лекція №14