Види генетичних рекомбінацій
Гомогогічна рекомбінація. Чужа ДНК рекомбінується з клітин ДНК шляхом обміну відповідними ділянками. Партнери повинні мати однакову нуклеотидну послідовність і мають бути максимально гомологічними.
Сайт-специфічна рекомбінація. Коротка дволанцюгова ДНК вбудовується в певному місці в довгу подвійну спіраль. Наприклад: інтеграція бактеріофага λ.
Негомологічна рекомбінація. Беруть участь негомологічні елменти ДНК. Це інтеграційна форма рекомбінації. На таку рекомбінацію здатні:
- вставочні (інсерційні) послідовні IS (ознак не кодують)
- траспозони Tn (містять гени стійкості до антибіотиків)
- бактеріофаг µ (він виконує роль і фагу, і гігантського транспозону)
У бактерій ДНК з клітини в клітину транспортується шляхом: кон’югації, трансдукції і та трансформації, а потім в клітині - реципієнті відбувається рекомбінація.
КОН’ЮГАЦІЯ
Кон’югація - це перенос генетичного матеріалу шляхом прямого контакту між клітинами. В 1946 р. Джошуа Ледерберг і Едвард Татум експериментально довели, що між бактеріями можливе свого роду спарювання.
Для дослідів були використані ауксотрофні мутанти E.coli, кожен з яких вимагав для росту 2 або 3 амінокислоти. Таким чином виключалася можливість простої реверсії (рис. 1).
Рис. 1. Рекомбінація при кон’югації двох мутантів E.coli К-12
На чашках з’явились колонії з генотипом A+ B+ C+ D+.
Дослідження механізму кон’югації показали, що він починається з наближення клітин двох штамів і виникнення між ними кон’югаційного містка, в утворенні якого беруть участь F-пілі (fertility - плодючість).
Хромосома донора в певному місті розривається, потім реплікується і заново синтезований ланцюг 5’- кінцем проштовхується в середину клітини-реципієнта. Там відбувається рекомбінація між ДНК донора і реципієнта (рис. 2).
Кон’югація описана у бактерій родів Esherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Nocardia. Здатність клітин бути донором пов’язана з наявністю у них статевого фактора F, яки й у разі кон’югації передається від однієї клітини до другої. Фактор F – це кільцева дволанцюгова ДНК (плазміда). Клітини, що не містять фактора F (F-), можуть функціонувати тільки як реципієнти. При кон’югації частота передачі фактора F наближається до 100%.
Рис. 2. Взаємовідносини між статевими типами E.coli (за Шлегелем, 1987)
У популяції F+ лише деякі клітини можуть бути донорами хромосомної ДНК. Це, зокрема, ті клітини, у яких фактор F інтегрувався в хромосому. Клітини-донори, що забезпечують високу частоту рекомбінації, називають Hfr (англ. higt frequency of recombination).
Як правило в клітину-реципієнт переноситься лише частина генетичного матеріалу клітини донора, в результаті чого утворюється неповна зигота — мерозигота, яка містить частину геному донора і повний геном клітини-реципієнта. Ділянки перенесеної від донора ДНК знаходять гомологічні ділянки в молекулі ДНК реципієнта, між якими проходить генетичний обмін. В результаті частина донорної ДНК вбудовується (інтегрується) в геном реципієнта, а відповідна частина реципієнтної ДНК з нього виключається. Ефективність інтеграції дуже висока: якщо донорний ген перенесений в клітину-реципієнт то ймовірність його включення складає приблизно 0,5.
За допомогою явища кон’югації можна виявити генетичну послідовність ДНК: перериваючи зв’язок між партнерами і вивчаючи, які гени були перенесені за певні проміжки часу, можна побудувати генетичну карту бактеріальної хромосоми. Перенос всієї хромосоми E. coli при температурі 370 C триває 100 хв.
ТРАНСДУКЦІЯ
Це явище описали у 1951 р. Леденберг і Циндер на прикладі фагу Р 22 у Salmonella typhimurium.
Трансдукція — передача ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта за участю бактеріофагів. Однак не всі фаги можуть здійснювати трансдукцію і не у всіх бактерій ДНК може бути перенесена таким шляхом. Відкрито у представників родів Esherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio, Rhizobium.
Розрізняють два види трансдукції – загальну (неспецифічну) і специфічну. Неспецифічна трансдукція полягає у тому, що під час репродукції фага в клітині господаря, в капсиди замість фагової ДНК можуть включатися фрагменти ДНК бактеріальної хромосоми. Таким чином фаголізат містить суміш нормальних і дефектних фагів. Зараження клітин нормальним фагом веде до їх лізису. Зараження клітин бактеріальним дефектним фагом призводить до трансдукції (рис. 3).
Рис. 3. Утворення фагових частин, які здійснюють загальну трансдукцію, і введення донорної ДНК в інфіковану клітину. Один із трансдукуючих фагів несе бактерійний ген х дикого типу, який при подальшому інфікуванні вводиться в бактерійну клітину, що несе мутантний ген х-.
При специфічній трансдукції бактеріофаг вбудовується чітко в певні ділянки бактеріальної хромосоми, наприклад., фаг λ встроюється між галактозним опероном і біоти новою ділянкою (gal і bio). Галактозний оперон відповідає за утилізацію галактози, біотинова ділянка – за синтез біотину - вітаміну H. Cирі яйця містять авідин - білок, який утворює з біотином нерозчинний комплекс.
ТРАНСФОРМАЦІЯ
Трансформація полягає в зміні властивостей одних бактеріальних клітин під впливом ДНК, яка виділена з інших бактеріальних клітин. Для трансформації не потрібний безпосередній контакт між клітинами. Гени можуть передаватися з клітини в клітину без всякого міжклітинного контакту і без переносників за допомогою вільної розчинної ДНК, що виділена з клітин-донорів.
Трансформація була вперше виявлена Фредом Гріффітом у 1928 р. при вивченні Streptococcus pneumonia (рис. 4). Він ввів мишам невелику кількість авірулентних безкапсульних клітин R-штаму (від англ. rough - гладкий) і вбиті нагріванням вірулентні капсульні клітини S-штаму (від англ. smooth - шершавий). Логіка експерименту полягала у наступному:
1. S-штам викликав загибель мишей;
2. R-штам не викликав загибелі;
3. S-штам, вбитий нагріванням не викликав загибелі;
4. Нагрітий S-штам + живий R-штам викликав загибель. З крові мишей, які загинули, були виділені вірулентні капсульні бактерії S-штама.
Рис. 4. Схема трансформації in vivo (дослід Ф.Гріффіта) (за Г. Стентом і Р. Келіндаром, 1981)
Це означало, що вбиті S-клітини передали здатність утворювати капсули R-клітинам за допомогою якогось фактора. Пізніше, в 1944 році, було встановлено, цим фактором є ДНК (Освальд Ейвері, Мак Леод, МкКарті).
Здатність ДНК проникати в клітину - реципієнту залежить як від природи самої ДНК, так і від фізіологічного стану самої клітини - реципієнта. Трансформуючою ДНК можуть бути тільки високомолекулярні дволанцюгові фрагменти. Проникати в бактеріальну клітину може ДНК, яка виділена з різних джерел (організмів), але включатися в геном — лише з певним ступенем гомологічності.
Після того, як екзогенний фрагмент ДНК, що проникає в клітину, знайшов гомологічний фрагмент ДНК клітини - реципієнта, між ними відбувається генетичний обмін аналогічно тому, як це має місце на останньому етапі кон’югації.
Проникний в клітину - реципієнта фрагмент спорідненої ДНК здатний викликати трансформацію з достатньо високою частотою – 0,2 - 0,3 (20%-30%).
Коли бактерії лізуються, то звільнюється певна кількість ДНК в оточуюче середовище. Ці фрагменти можуть бути відносно великими і містити декілька генів. Якщо такі фрагменти контактують з компетентними клітинами, то вони здатні проникати всередину клітини і здійснювати трансформацію. Це природній процес, який відбувається в ґрунті та на морі.
Генетична трансформація встановлена для родів Diplococcus, Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas, Streptococcus. Цим способом передаються ознаки стійкості до різних отрут і прототрофність до окремих амінокислот. Трансформація здійснюється лише у певний період росту, коли клітини можуть поглинати молекули або фрагменти молекул ДНК. Цей період припадає здебільшого на середину експоненціальної фази росту. Період, коли клітина здатна поглинати ДНК, називається компетенцією. Компетентні клітини становлять приблизно 15% від всієї популяції.
СЕЛЕКЦІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ
Дослідження геному мікроорганізмів, принципів його організації та функціонування має важливе значення для направленої селекції високопродуктивних штамів, що використовуються в промисловості.
У виробництві різних мікробних препаратів застосовують природні штами; штами, змінені в результаті мутацій; штами, одержані в методами генної і клітинної інженерії.
Природні штами використовуються здебільшого для виробництва біомаси, бактеріальних добрив і біоінсектицидів. Вони, як правило, не нагромаджують надлишку будь-якого метаболіту, оскільки у них наявні високоефективні регуляторні механізми. Тому у виробництвах, де цільовим продуктом є речовини, що виділяються клітинами у середовище, використовують генетично змінені штами.
Генетично змінені штами (штами, змінені в результаті мутацій) використовують у виробництвах, де одержують речовини, що виділяють клітини в середовище: продуценти антибіотиків, ферментів, органічних кислот, вітамінів, амінокислот.
Штами, які отримані методом генної інженерії. За допомогою методів передачі генетичної інформації в клітину-реципієнт створюються штами із заданими ознаками. Найчастіше використовують переносникі - вектори, плазміди, які вносять чужорідну ДНК і утворюють рекомбінантну (химерну) ДНК, а також протопласти, при злитті яких утворюються стабільні рекомбінанти. За допомогою генно-модифікованих штамів бактерій налагоджено промислове отримання інсуліну, соматотропіну, інтерферону тощо.
Лекція №16
Тема: НОРМАЛЬНА МІКРОФЛОРА ЛЮДИНИ
Нормальну мікрофлору людини слід розглядати як сукупність багатьох мікробіоценозів, які характеризуються певним кількісним і якісним складом і займають конкретні біотопи в організмі.
Для кожної ділянки тіла характерна своя мікрофлора. Розрізняють автохтонну (резидентну) – постійно присутню мікрофлору, стабільну за своїм складом, вона виявляє певну локалізацію у людей одної вікової групи, а також алохтонну (тимчасову, заносну) – транзитну, що розглядається як додаткова, випадкова флора, що занесена з інших біотопів хазяїна або з оточуючого середовища.
Автохтонні мікроорганізми є сапрофітами. Їх розвиток обумовлений рядом фізіологічних факторів – температурою, вологістю, рН, наявністю субстратів.
Представники аутофлори фіксуються в певних місцях шкіри і слизових оболонок шляхом взаємодії поверхневих бактеріальних структур – мембран і пілей, які містять речовини гліколіпідної природи з рецепторами (глікопротеїнами) мембран епітеліальних клітин.
Прикріпившись, мікроорганізми продукують речовини, які утворюють біоплівку завтовшки від долей до десятків мікрометрів. Вона складається з екзополісахаридів мікробного походження, муцину, що продукується клітинами господаря та міліардів мікроколоній. В складі такої біоплівки мікроорганізми стають значно стійкішими до зовнішніх, в тому числі інфекційних факторів. Цей факт є базисним в розумінні ролі нормальної мікрофлори для проти інфекційного захисту організму.
При формуванні індивідуального мікробного пейзажу організму людини певну роль відіграє генотип, який визначає білкову структуру рецепторного апарату клітин, білкову специфічність муцину тощо. Утворення мікробних екосистем обумовлено динамічною рівновагою між мікрофлорою та імунітетом. Саме імунна система визначає характер ауто флори та сприяє її стабільності. Деякі представники мікрофлори не індукують утворення антитіл, інші – мають однакові антигенні компоненти з клітинами тканин людини (явище імунологічної мімікрії).
Слід відзначити, що абсолютно ідентичних мікробних систем у людини не існує. Кожний індивідуум характеризується своїм мікробним фенотипом. Склад мікрофлори визначається спадковістю, родинною індивідуальністю, залежить від традицій харчування, побутових умов, регіону проживання, екзоекологічних впливів тощо.
Транзитні мікроорганізми є непатогенними або умовно-патогенними мікробами, вони потрапляють в організм людини з оточуючого середовища. При цьому вони можуть не викликати захворювань, але знаходитись тривалий час на шкірі та слизових оболонках.
Організм людини населяють понад 500 видів бактерій, біля 50 видів вірусів і понад 20 видів найпростіших. Загальна кількість мікроорганізмів досягає 1014-1016, що є на 1-3 порядка більше, ніж всіх клітин макроорганізму. Таким чином на кожну соматичну клітину тіла людини припадає від 10 до 1000 клітин мікробів-симбіонтів.
Дослідження мікрофлори людини проводять при діагностиці ендогенних інфекцій, дисбактеріозів, бактеріоносійства, у космонавтів, членів екіпажів підводних човнів та полярних експедицій для уникнення бактерійної несумісності.
При розгляді питань кількісного та якісного складу мікрофлори людини слід відзначити, що сучасні технічні методи не дозволяють культивувати до 50% анаеробних бактерій, які входять в її склад, що серйозно ускладнює створення об’єктивної мікробіологічної карти організму людини. Такі мікроекологічні дослідження можуть бути однією з цікавих перспектив в розвитку мікробіології.