Фотореактивація (світлова репарація)

Якщо безпосередньо після опромінювання ультрафіолетом подіяти видимим світлом (320-550 нм), то доля клітин, що вижили, буде в десятки разів більше. Світло активує фермент, який розчеплює димери тиміна і тільки їх, причому не має значення, ушкодження відбулися на одно- чи дволанцюговій ДНК.

Темнова реактивація (репарація)

При темновій репарації вирізається сегмент ДНК (приблизно 30 п.н), добудовується з використанням неушкодженого ланцюга ДНК в якості матриці.

-A-T- -A - T-

-G-C- УФ -G - C-

-T-A- (254нм) T A-

-T-A- T A-

-C-G- інактивація -C - G-

-G-C- -G - C-

Видиме світло + Темрява + фермент

фермент

-A T- - А - T- -A T-

-G C- -G C- -G C-

-T A- -T A- -T A-

-T A- -T A- -T A-

-C G- -C G- -C G-

-G C- -G - C- -G C-

Фотореактивація Темнова реактивація

Дуже стійкий до впливу УФ-променів Deinococcus radiodurans (стара назва Micrococus radiodurans), які виявлені в уранових рудниках4 вони здатні витримувати 3-7 млн рад (для людини доза у 100 рад є смертельною).

Рентгенівські промені, γ-промені, протони, нейтрони теж можуть викликати мутації. Раніше згадувалось, що іонізуюче опромінення всіх видів частіше викликають одноланцюгові розриви в ДНК, на порядок менше розривів в обох ланцюгах.

Хімічні мутагени. Вони виявляють найрізноманітніший вплив на генетичний апарат клітин.

Аналоги азотистих основ дуже подібні за будовою до нормальних основ і включаються клітинами в ДНК. Найчастіше використовують бромураціл (аналог тиміну) та 2-амінопурин (аналог аденіну).

Кетоформа 5-бромуроцила, яка легко утворює пару з А, може таутомеризуватися в енольну форму, яка утворює пару переважно з Г, а не з А. Тоді при наступній реплікації основа Г обумовить включення Ц в комплементарний ланцюг. Аналогічно діє 2-амінопурин, який може «упізнаватись», як аденін і як гуанін.

реплікація

реплікація

реплікація

А—Т А—БУ БУ—Г Г—Ц

БУ

Азотиста кислота викликає дезамінування амінопуринів (аденін) з утворенням гіпоксантина, який утворює пару з цитозином, а не з тиміном. В результаті відбувається неправильне спарювання і мутації типу АТ ГЦ.

Профлавін та інші акридинові барвники вбудовуються між сусідніми основами ДНК і збільшують відстань між ними (інтеркаляція). Такі просторові зміни при реплікації ДНК можуть призвести до серйозних порушень в ході зчитування інформації при синтезі білка (зсув рамки зчитування).

Алкілуючі агенти (етил-і метилметансульфонати, етиленамін, азотистий або сірчаний іприт) належать до найбільш ефективних мутагенів. Наприклад: етилметансульфонат, етилує (приєднує алкільні групи) до N-атому гуаніну. Утворюється 7-алкілгуанін, що відщеплюється від ланцюга, в результаті чого утворюється «пропуск». При наступному акті реплікації на цьому місці виявляється помилкова основа або делеція.

Біологічні мутагени — це фаг µ, міграційні генетичні елементи (IS (800-1400 пар основ), Tn — транспозони (2000 пар основ)). Вони інтегруються в різні ділянки хромосоми і викликають мутації типу інсерцій.

Для того, щоб виявити мутантів з певними цікавими для нас якостями існують різноманітні методи: середовища з додаваннями антибіотиків, метод відбитків, з використанням індикаторів.

BOX

РУХОМІ ГЕНИ На початку 50-х років Барбара Мак-Клінтон, вивчаючи в Колд-Спрінг-Харборській лабораторії генетику кукурудзи, привернула увагу дослідників до незвичайної поведінки групи генів, які вона назвала «регуляторними елементами». Ці гени, ідентифіковані за їх властивостями подавляти експресію інших генів кукурудзи, які знаходилися з ними в близькому контакті, не мали фіксованого положення в хромосомах. Вони ніби рухались по геному рослини. Регуляторні елементи могли приєднуватись і відщеплюватись, при чому після їх відщеплення дуже часто відновлювались раніше «німі» гени. Виявилось, що гени, асоційовані з регуляторними елементами, стають не стабільними і часто мутували за нестабільності самих елементів. Протягом багатьох років кукурудза зоставалась єдиною системою, в якій виявлялись такі рухомі генетичні елементи. Потім з’явились попередні дані, які свідчили про те, що деякі гени дрозофіли характеризуються високою частотою мутації і, напевно, також асоційовані з регуляторними елементами. Але більшість генетиків не звертали увагу на ці дані до тих пір, поки в кінці 60-х років не було доведено, що деякі плейотропні (тобто ті, що впливають на декілька різних функцій) мутації у E.coli обумовлені вбудовуванням в хромосому великих сегментів ДНК, названих інсерційними послідовностями (IS). IS1 Ген транспозази 24bp 720bp 24bp Tn1681 Ген термостабільного токсину І E.coli IS1 552bp IS1 Рис. 1. Інсерційна послідовність і транспозон, що нею генерується. IS1 містить ген ферменту транспозази, відповідальний за його переміщення. Цей ген фланкований повтореннями із 24 нуклеотидних пар (bp). В нижній частині малюнка зображений транспозон (Tn), що включає два таких IS-елемента, між якими знаходиться певний ген (в даному випадку ген термостійкого токсину, що викликає діарею). Важливо, що в багатьох незалежних актах інсерції брали участь одні і ті самі сегменти ДНК. Були знайдені 4 основних групи інсерційних послідовностей, названі IS1, IS2, IS3 і IS4. В хромосомі E.coli розкидані багаточисельні копії елементів IS1 і IS3. До пересування здатні не тільки індивідуальні IS-елементи; коли два таких елемента розташовані достатньо близько один від одного, вони можуть пересуватися як єдине ціле, захоплюючи лежачі між ними гени. Такі складні рухомі структури називаються транспозонами. З розвитком методів рекомбінантних ДНК з’явилась можливість клонувати IS-елементи всіх типів разом зі специфічними фланкуючими послідовностями. Порівняння послідовностей між IS-елементами і хромосомною ДНК показало, що вони можуть приєднуватись в багато ділянок хромосоми E.coli. Не менш важливим є те, що послідовності бактеріальної ДНК, фланкуючі IS-елементи зліва, завжди ідентичні послідовностям, що прилягають до правого кінця цього елемента. Така організація вказує на те, що сам акт інсерції, напевно, включає утворення в акцепторному сайті хромосоми розриву з липкими кінцями, між якими і приєднується донорний транспозон. Зигзагоподібний розрив в хромосомі A T T A T T A A T A Т А А Т А А Т Т А Т Транспозон Т А А Т А А Т Т А Т A T T A T T A A T A A T T A T T A A T A Переміщення транспозона полягає в утворенні нового дочірного транспозона Напевно, вираз «транспозон переміщається» не повністю точний, так як при появі транспозона в новій локалізації в первинному положенні він не зникає. Замість цього батьківський транспозон дає початок новій копії, яка приєднується в іншому місці бактеріальної хромосоми. Як це відбувається, до сих пір остаточно не відомо. Існує думка, що цей процес включає утворення розривів як у донорній, так і в акцепторній молекулі ДНК; потім донорна і акцепторна молекули з’єднуються з утворенням Х-подібних проміжних структур, в яких по дві сторони від транспозона знаходиться реплікативні вилки. В результаті реплікації утворюється два транспозона: один в первинному положенні, а другий - в акцепторній молекулі ДНК. Транспозиція закінчується сайт-специфічною рекомбінацією в межах транспозона, яка призводить до точного відновлення вихідної структури рухомого елемента і до утворення нового такого елемента, фланкованого знову утвореними прямими повторами. Таким чином, для транспозиції необхідна дія кількох сайт-специфічних нуклеаз. Одна із них вносить розрив з липкими кінцями на протилежних кінцях рухомих елементів, а інша-акцепторна область. Напевно, дві цих реакції каталізує один фермент - транспозаза; такі ферменти кодуються генами, розташованими в самих транспозонах. Мутаційний аналіз показав, що активність цього ферменту суворо необхідна для транспозиції. Встановлено, що синтез мРНК для транспозази регулюється білком-репресором, також кодуючим транспозоном. Зв’язуючись з відповідною операторною ділянкою в ДНК транспозона, цей репресор блокує синтез транспозази, в результаті чого утворення нової копії транспозона є дуже рідким явищем. Цікавим є те, що цей репресор також каталізує акт сайт-специфічної рекомбінації, яким закінчується транспозиція. Таким чином, при наявності відповідного сигналу репресор приймає участь у сайт-специфічній рекомбінації у ролі ферменту. Яким чином цей білок виконує дві дуже різних функцій, залишається незрозумілим.

Транспозони мігрують по геному клітини і вбудовуються в різні ділянки даного генома та \ або здатні мігрувати з одного генома в інший. При гібридизації одноланцюгової ДНК, що містить IS - елемент з гомологічною ДНК без IS - елементів утворюються дволанцюгова ДНК з одноланцюговою «петлею» - це і є IS - елемент (найпростіший транспозон).

Tn містить 1 ген (для транспозази) або більше. Можуть вбудовуватися в плазміду. Переносять гени з плазміди в хромосому (є в дріжджах, маісі, дрозофілі, людині).

ГЕНЕТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ

У еукаріот в процесі запліднення відбувається злиття двох гаплоїдних наборів генів, в результаті чого утворюються диплоїдна зигота. В ній проходить перекомбінація хромосом (кросинговер), і пізніше після редукційного поділу (мейозу) знов утворюються гаплоїдні гамети. Це статевий спосіб перетасовки генетичного матеріалу.

Бактерії завжди гаплоїдні. Але вони можуть передавати частину генетичного матеріалу з клітини-донора в клітину-реципієнта. Внаслідок цієї передачі утворюється так звана неповна зигота або мерозигота, яка містить частину генетичного матеріалу донора і всі гени реципієнта.

При наступному поділі ядра і клітини утворюються клітини з рекомбінантною хромосомою.

Рекомбінація - це процес в якому утворюється нова рекомбінантна хромосома, з генотипом, відмінним від обох батьків, шляхом комбінування генетичного матеріалу від двох організмів. Це процес обміну генетичним матеріалом, який належить різним особинам, в результаті чого виникають особини з рекомбінантним геномом. Нових генів в генофонді не з’являється — в цьому принципова відмінність рекомбінацій від мутацій.

Частину ДНК, що передається в клітину називають екзогенотою. Якщо ця ДНК стає стабільною частиною геному клітини-реципієнта, то вона стає ендогенотою. Ендогенотою така ДНК стає у двох випадках:

1. Коли вона інтегрується в хромосому.

2. Коли вона поступає в клітину у формі, недоступній клітинним ендонуклеазам. Тоді в неї немає необхідності інтегруватись в геном (наприклад у плазміди).

Незалежно від способу передачі ДНК екзогенота має лише 4 можливих долі в клітині:

1. Екзогенота може мати гомологічні ділянки з ендогенотою; інтегруватись в геном і призвести до утворення рекомбінантного геному.

2. Екзогенота іноді зберігається поза ендогенотою, реплікується утворюючи клон частково диплоїдних клітин.

3. Екзогенота може вижити, але не реплікуватись, тоді тільки 1 клітина стає частково диплоїдною.

4. Нуклеази клітин-господаря руйнуються екзогеноту, а процес називається рестрикція (вирізання).