2. Интерферон

Интерфероны(ИФН, от англ.interfere- препятствовать, мешать) - гликопротеиды, секрети-руемые многими клетками организма в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Наиболееактивно синтезируют белки интерферона клетки белой крови: лейкоциты, Т-лимфоциты, естест-венныеклетки-киллеры, макрофаги идр.

В 1957 г. англ. вирусологи А. Айзекс и Ж. Линдеман обнаружили, что клетки, зараженныевирусом гриппа, вырабатывают особое вещество, угнетающее размножение как гомологичных, такигетерологичныхвирусов, котороеониназвали интерфероном.

Сначала были выявлены два типа интерферонов - I и II, которые продуцируют разные клеткиорганизма млекопитающих. Выработка интерферона у животных определяется врожденными осо-бенностями организма, возрастом (например, новорожденные животные из-за недостаточной про-дукции интерферона более чувствительны к вирусным заболеваниям, чем взрослые). Кроме того,на продукцию интерферона тканями организма влияют климатические условия (например, в зим-нее-осений период продукция интерферона ниже, чем в весенне-летний), различные виды облуче-ния(например,ионизирующееоблучениеживотныхснижаетпродукциюинтерферона).

Дальнейшее изучение интерферонов привело к созданию международной номенклатурыспециальной комиссией ВОЗ в 1980 г. Согласно ей требуется учитывать видовую принадлежностьинтерферона (человеческий, бычий, свиной, мышиный и т.д.), антигенную специфичность (α, β, γ,δ, κ, τ), источник получения (лейкоциты, фибробласты, лимфоциты и т.д.), молекулярную массу.Интерфероны закодированы в генетическом аппарате клетки. Стимулами, или индукторами, про-дукции интерферонов могут быть вещества различной природы, такие как молекулы РНК, внутри-клеточныепаразиты, продуктыжизнедеятельности микроорганизмови др.

Промежуток времени между взаимодействием индуктора с клеткой и появлением интерфе-рона(lag-период) обычно составляет 4-8 ч.

Интерферонневзаимодействуетнепосредственносвирусом,оннепрепятствуетадсорбции

вируса на клетке и его проникновению в клетку. Антивирусное действие интерферона связано сповышением активности ряда ключевых ферментов клеточного обмена веществ, в том числе про-теинкиназы, под действием которой один из белков, инициирующий трансляцию, переходит в не-активное состояние. В результате этого нарушается формирование комплекса факторов, иниции-рующих трансляцию (иРНК, малая рибосомальная единица, инициирующие белки) и трансляциивирусных белков непроисходит.

Наиболеехарактерныесвойстваинтерфероновследующие:

• видотканевая специфичность - высокая активность в гомологичных системах и очень низ-кая в гетерогенных (так, для лечения человека используют интерфероны только человеческогопроисхождения);

• избирательнаяактивностьпоотношениюкразнымгруппамвирусов;

• высокаяпротивовируснаяактивностьвнебольшихдозах.

При изучении интерферонов было показано, что помимо противовирусного, антибактери-ального(особеннокграмположительнымбактериям),антипаразитарного,противоопухолевогодействия, они обладают выраженным иммуномодулирующим свойством. Интерфероны стимули-руют активность природных клеток-киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов, повышают чув-ствительность к ним клеток-мишеней, стимулируют фагоцитоз, антителообразование, фиксациюкомплементаи т.д.

Биологическая активность у разных интерферонов может быть выражена в разной степени,например, α- и β-интерфероны обладают более высокой противовирусной активностью, чем γ-интерфероны,которыеимеютвомногоразбольшую иммуномодулирующуюактивность.

По происхождению различают два вида интерферона: эндогенный и экзогенный. Эндоген-ный интерферон вырабатывается клетками организма животного (in vivo), а экзогенный синтези-руется искусственно (in vitro) и применяется для профилактики и лечения некоторых вирусныхинфекций, таких как грипп, гепатит В, герпес и др. Препарат эффективнее на ранних стадиях за-болевания.

2. Природные, или естественные, киллеры(ЕК-клетки, англ.NK-natural killers) были об-наружены в 1976 г. в лимфоидной ткани. Они происходят из клеток-предшественников костногомозга и представляют собой популяцию лимфоидных клеток, лишенных признаков Т- или В-лимфоцитов. Содержание ЕК-клеток в крови составляет 5 - 20 % от общего числа лимфоцитов, впечени - 42 %, селезенке - 36, лимфоузлах - 3, легких - 5, тонкой кишке – 3, в костном мозге - 2 %.ВотличиеотцитотоксическихТ-лимфоцитовкиллернаяактивностьЕК-клетокнезависитотпредставленияимчужеродных антигенов молекуламиГКГСI.

Распознавание иуничтожение клеток-мишеней ЕК-клетками не требуетпредварительнойсенсибилизации (иммунизации) и не сопровождается образованием клеток памяти. ЕК-клетки иг-рают важную роль в защите организма против опухолевого роста, метастазов опухолей и вирус-ных инфекций. По существу, естественные киллеры участвуют в первой линии защиты организмаот антигена еще до включения специфических иммунных механизмов (вторая линия защиты). Ужев начале вирусной инфекции проявляется их высокая противовирусная активность. Естественныекиллерыпроявляютсвоепротивовирусноедействиевтечениепервыхтрехднейпослезаражения,ацитотоксическиеТ-лимфоциты испецифическиеантитела —толькочерез4-7 дней.

ЕК-клетки вызывают лизис клеток-мишеней независимо от антител и комплемента и не об-ладаютспособностью кфагоцитозу.

Механизм действия ЕК-клеток проявляется в том, что они синтезируют особый белок, кото-рый по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам сходен с перфорином, вызы-вающим образование пор в мембране клеток-мишеней. Кроме того, ЕК-клетки содержат гранзи-мы, обусловливающие индукцию апоптоза (запрограммированной гибели клетки) при проникно-вении в клетки-мишени. После лизиса клеток-мишеней ЕК-клетки остаются жизнеспособными имогутвступатьвовзаимодействиесновымиклетками.ЕК-клеткивызываютгибельклеток-мишеней значительно быстрее, чем Т-лимфоциты, - в течение 1 - 2 ч, поскольку для Т-лимфоцитовтребуетсяактивацияидифференцировкаввидеклеточного иммунногоответа.

Помимо ЕК-клеток, обладающих естественной цитотоксичностью, существуют ЕК-клетки,имеющие рецепторы к Fc-фрагментам антител. Они обеспечивают антителозависимую клеточнуюцитотоксичность(АЗКЦ),котораязаключаетсявразрушенииклеток,инфицированныхвирусоми

покрытыхантителами(опсонизирован-ных).

Благодаря скоординированному взаимодействию макрофагов, интерферонов, комплемента,ЕК-клеток, ГКГС еще до развития специфического иммунитета уже обеспечивается своевремен-ноераспознаваниеиначинаетсяуничтожениегенетическичужеродных веществ.

2. Специфические факторы иммунитета.Специфическая система иммунитета имеет своииммунокомпетентные органы - центральные (костный мозг, тимус фабрициева сумка у птиц, пе-чень у млекопитающих) и периферические (селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные тканижелудочно-кишечноготрактаи миндалин).

«Исполнителями» специфического иммунного ответа являются макрофаги (а также другиеантигенпредставляющие клетки), различные популяции и субпопуляции Т- и В-лимфоцитов. Воз-никнув из общей исходной (так называемой стволовой) клетки, они проходят соответствующуюдифференцировку от предшественников в центральных органах иммунной системы. Дифференци-ровкаТ-лимфоцитоввиммунокомпетентныеклеткипроходитвтимусе.СозреваниеВ-лимфоцитов проходит у птиц в бурсе, у млекопитающих - сначала в печени плода, а затем, послерождения,вкостноммозге.

Зрелые В- и Т-лимфоциты приобретают иммунокомпетентность - способность распознаватьчужеродные антигены. Они покидают костный мозг и тимус и заселяют селезенку, лимфатическиеузлы и другие скопления лимфатических клеток. Такая постоянная циркуляция обеспечивает кон-такткакможнобольшегочисласоответствующихлимфоцитов сантигеном(вирусом).

Каждая В-клетка генетически запрограммирована на синтез антител к одному определенно-му антигену.Встретивираспознавэтотантиген,В-клетки пролиферируют(размножаются) идифференцируются в зрелые плазматические клетки (плазмоциты), секретирующие антитела про-тив него. Другие В-лимфоциты, пройдя два-три цикла деления, превращаются в клетки памяти,которые не способны синтезировать антитела. Они могут циркулировать длительное время (от не-скольких месяцев и до нескольких лет) без деления, определяя продолжительность приобретенно-го иммунитета. При повторном поступлении антигена в организм они его быстро распознают иприобретают способность к пролиферации с последующим превращением в плазмоциты, секрети-рующиеантитела.

Так же образуются клетки памяти из Т-лимфоцитов. Клетки памяти можно назвать «резер-вом»иммунокомпетентныхклеток.

У Т- и В-лимфоцитов обнаружены разные поверхностные рецепторы (маркеры), которыеобеспечивают выполнение различных функций. На этом основании выделяют следующие основ-ныесубпопуляции лимфоцитов:

• Т-хелперы(помощники)-взаимодействуютсВ-лимфоцитами,стимулируютихпролифе-рациюитрансформациювплазматическиеклетки, синтезирующиеантитела;

• Т-супрессоры-угнетаютпролиферациюВ-лимфоцитов,способствуютразвитиюиммуно-логическойтолерантности и др.;

• Т-киллеры(цитотоксические)-разрушаютчужеродныеклетки,клетки,инфицированныевирусами,клетки опухолей и др.;

• Т-лимфоцитыпамяти-сохраняютинформациюобантигенеипередаютеедругимклет-

кам;

• В1(Т-независимыелимфоциты)-участвуютвобразованииантителбезвзаимодействияс

Т-лимфоцитами;

• В2(Т-зависимыелимфоциты)-превращаютсявплазматическиеклеткиспомощьюТ-хелперов;

• ВЗ(киллеры)-разрушаютклеткимишенибезкомплемента,носпомощьюантител;

• В4(супрессоры)- угнетаютпролиферациюТ-лимфоцитов;

• В5(лимфоцитыпамяти)-приповторномпопаданииантигенаворганизмсинтезируютиммуноглобулиныклассаG.

Различают два варианта иммунного ответа (таблица 1): первичный (через 4 - 7 дней послепервой встречи с антигеном) и вторичный (после повторного контакта). Они различаются по про-должительности латентного периода, скорости нарастания титра антител, общему количеству син-тезируемых антител, последовательности синтеза иммуноглобулинов различных классов. Клеточ-ныемеханизмы первичногои вторичногоиммунного ответатакжеразличны.

Индукция иммунного ответа при вирусной инфекции начинается с поглощения возбудите-ля макрофагами и другими антигенпрезентирующими клетками (клетки Лангерганса кожи, ден-тритныеклеткии др.).

В макрофагах происходит расщепление (процессинг) вирусных частиц до отдельных ком-понентов. При этом вирусные белки (антигены) расщепляются на короткие пептиды (антиген-ные детерминанты), которые в составе комплекса с белками ГКГС (I, II класса) экспонируются(презентируются) на поверхности макрофагов и связываются с рецепторами соответствующихТ-лимфоцитов (Т-киллеров и Т-хелперов). Затем Т-лимфоциты начинают пролиферировать. ВрезультатеэтогоформируютсяразличныесубпопуляцииантигенстимулированныхТ-лимфоцитов. Особенность развития специфического противовирусного иммунитета - преиму-щественное формирование субпопуляции Т-киллеров, которые разрушают инфицированные ви-русом клетки, субпопуляция Т-хелперов участвует в пролиферации В-лимфоцитов, которые вдальнейшем созревают и превращаются в плазмоциды, секретирующие иммуноглобулины, ко-торыеобеспечиваютгуморальныйиммунитет.Приэтомиммуноглобулиныиграютгораздоменьшуюроль, чемТ-лимфоциты.

Вирусные пептиды могут выделяться из макрофагов в межклеточное пространство и свя-зываться с В-лимфоцитами с последующим их делением и дифференциацией в плазматическиеклетки,секретирующиеантителаопределенногокласса(IgM,IgG,IgA,IgD, IgE).

Координированное взаимодействие макрофагов, Т- и В-лимфоцитов при встрече с антигеномобеспечиваеткак игуморальный, таки клеточныйиммунныеответы.

Для всех форм иммунного ответа требуется согласованное взаимодействие основных факто-ров иммунной системы: макрофагов, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, ЕК-клеток, системы интерфе-ронов, комплемента, ГКГС. Это взаимодействие осуществляется с помощью медиаторов, синтези-руемых клетками иммунной системы и участвующих в регуляции ее активности, которые называ-ются цитокинами (от греч.cytos- клетка иkineo- приводить в движение). Их подразделяют намо-нокины(продуцируются моноцитами и макрофагами) илимфокины(продуцируются активирован-ными лимфоцитами). Лимфокины, которые химически идентифицированы и получены в чистомвиде,было предложено (в1979 г.)назватьинтерлейкинами.

2. Основные особенности противовирусного иммунитета. Особенности проявления им-мунного ответа при вирусных заболеваниях определяются тем, что вирусы являются облигатнымивнутриклеточнымипаразитами сосвоеобразнымспособомрепродукции.

Выздоровлениеотвируснойинфекцииобеспечиваюттриосновныхфеномена:

• подавлениерепродукциивирусаинейтрализацияинфекционностивирионов;

• разрушениеинфицированныхклеток;

• образованиеинтерферона.

Ранняя стадия инфекции состоит в противоборстве вируса с защитными системами организ-ма-хозяина. Самый первый защитный барьер - кожные покровы и слизистые оболочки организма.В случае нарушения их целостности в действие вступают механизмы экстренной неспецифиче-ской защиты (факторы неспецифической резистентности). Среди них особо выделяют противови-руснуюактивность интерферона, ЕК-клетки имакрофаги.

Противовирусное действие интерфероназаключается в том, что он активирует защитныемеханизмынепораженных вирусомклеток,обеспечиваяихустойчивостькинфекции.

Интерферон действует в нескольких направлениях. Он оказывает влияние на клетки, сосед-ние с инфицированной, запуская в них цепь событий, приводящих к подавлению синтеза вирус-ных белков ивнекоторыхслучаях-сборки ивыходавирусных частиц.

В ответ на воздействие интерферона клетки вырабатывают большое количество протеинки-назы R. Этот фермент приводит к снижению уровня белкового синтеза в клетке. Интерферонзави-симое подавление трансляции губительно как для вируса, так и для клетки-хозяина. Интерфероныспособны также активировать сотни других генов, играющих роль в защите клетки от вирусов.Кроме того, интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путем активации белкар53,что ведет капоптотической смерти инфицированнойклетки.

Противовирусное действие ЕК-клеток и макрофаговпроявляется уже через двое суток по-сле заражения организма-хозяина вирусом. ЕК-клетки и макрофаги уничтожают зараженные клет-ки.ГлавнымобразомЕК-клеткиосуществляютреакциюантителозависимойклеточнойцитоток-

сичности(АЗКЦ).

Если вирусу удается преодолеть факторы неспецифической резистентности, он вызываетразвитие специфического клеточного и гуморального иммунных ответов. Главную роль в специ-фическом иммунном ответе играют факторы клеточного иммунитета (Т-киллеры и макрофаги).Факторы гуморального иммунитета (В-лимфоциты и антитела, которые они секретируют) в про-тивовирусном иммунном ответе играют менее значимую роль. Основные механизмы противови-русного иммунитета сводятся к уничтожению зараженных вирусом клеток (т.е. клеток, которыефактически являются «фабриками» по производству новых вирусов) и нейтрализации и блокиро-ванию распространения вирусныхчастиц.

Клеточный противовирусный специфический иммунитетобеспечивают Т-клетки, которыевыполняют разнообразные функции. Для их созревания и дифференцировки в активной субпопу-ляциинаибольшеезначениеимеютмакрофагиидругие антигенпрезентирующиеклетки.

Субпопуляция зрелых Т-хелперов активизирует плазматические клетки, которые синтезиру-ют антитела против вирусных антигенов. Кроме того, плазматические клетки участвуют в диффе-ренцировке Т-киллеров, а также в привлечении макрофагов и ЕК-клеток в очаг вирусной инфек-ции.

Субпопуляция Т-киллеров осуществляет противовирусный иммунологический надзор черезспецифическое разрушение инфицированных вирусами клеток с помощью синтезируемых имиперфоринов и гранзимов. Проникнув внутрь клетки-мишени, гранзимы через каскад реакций ак-тивируютэндонуклеазы,которыеспособствуютразрывуцепейДНК иразвитиюапоптоза.

Гуморальный противовирусный иммунитетобеспечивает блокировку распространения ви-руса в организме в основном за счет антител, которые синтезируются против различных вирусныхантигенов. Однако наибольшей защитной (протективной) противовирусной активностью облада-ют антитела к поверхностным гликопротеинам, локализованным в суперкапсидной оболочке усложных вирусов, в капсиде у простых или экспрессируюся в мембране зараженной вирусом клет-ки при его репродукции. Механизмы гуморального противовирусного иммунитета могут бытьразличными в зависимости от формы, в которой вирус находится в организме. При взаимодей-ствии антител с внеклеточной формой вируса (вирионом) они, адсорбируясь на поверхности ви-рионов, блокируют его жизненно важные функции, в частности прикрепление к клетке хозяина,проникновение в нее и последующее раздевание. Кроме того, считают, что антитела, активируясистему комплемента, вызывают повреждения оболочки некоторых вирусов и блокируют клеточ-ные рецепторы для вирусов. Однако в настоящее время этот процесс не считают существенным впротивовируснойзащите.

Другой механизм противовирусного действия антител связан с их воздействием на внутри-клеточную форму вирусной частицы. Этот механизм может осуществляться двумя путями. Пер-вый, основной путь заключается в том, что антитела, фиксированные на мембране пораженнойвирусом клетки, через Fc-фрагмент IgG взаимодействуют с ЕК-клетками, которые разрушают ин-фицированные клетки с помощью перфоринов и гранзимов (АЗКЦ). Второй, менее значимый путьдействия антител на вирус заключается в активизации ими системы комплемента, что приводит кразрушениюинфицированныхклеток.

Определённая конфигурация аминокислот на поверхности антигенов называетсяэпитоп, анесколько перекрывающихся эпитопов формируютантигенную детерминанту (АД). АД могутрасполагаться на поверхности и быть доступными для антител или АД могут быть скрыты в глу-бинеи выходитьнаповерхностьприизменении конформации белка.

Ввирусевыделяют2антигена.

1. Вирионные-находятсянаповерхностизаражённойклетки

2. Вирус-индуцированные-взаражённойклетке.

6. Механизмы «ухода» вирусов от иммунного надзора организма хозяина. В процессе эво-люции многие вирусы приспособились в той или иной степени избегать ответных реакций со сто-роныиммуннойсистемы.Эти особенностиспецифичныдля каждоговидавируса.

Наиболее эффективна антигенная изменчивость в детерминантах вирусных белков. Приме-рами могут служить ВИЧ, вирусы гриппа. Так, у вируса гриппа это свойство называется антиген-ным дрейфом (постепенные изменения) или шифтом (резкие изменения). Гуморальный иммунитеткэтимвирусныминфекциямсохраняетсялишьдопоявленияновогосеровариантавозбудителя,

чтонепозволяетрассчитыватьнадолговременныйэффектвакцинации.

Некоторые вирусы (цитомегаловирусы, аденовирусы и др.) индуцируют синтез белков, по-давляющих экспрессию молекул ГКГС I на мембране пораженных клеток. Это дает вирусу воз-можностьизбежать распознавания этихклетокТ-киллерами.

Отдельные вирусы (герпесвирусы) обладаютгенамибелков, гомологичных цитокиновымрецепторам. Эти белки, находящиеся в крови, называются растворимыми рецепторами и действу-юткак ловушки,связывая цитокины инейтрализуя ихдействие.

Филовирусы (Эбола, Марбург), а также некоторые представители семейства аренавирусованалогичным способом избегают действия нейтрализующих антител. Они продуцируют большоеколичестворастворимыхвирусныхбелков,которыесвязываютэти антитела.

Некоторые вирусы (Эпштейна-Барр, аденовирусы) способны противодействовать эффектуинтерферонов. Они продуцируют короткие отрезки РНК, которые подавляют активизацию проте-инкиназы.

Многие вирусы могут вызывать у макрофагов синтез супрессирующих цитокинов, подав-ляющихразвитиеиммунного ответа.

Есть вирусы (ИНАН, чумы собак и др.), которые, проникают в клетку путем слияния клеточ-ных мембран и вирусных оболочек. В процессе репродукции в клетке они вызывают слияние обо-лочек инфицированной и соседней с ней клеток, таким образом обеспечивая передачу вирусногогеномаизклеткивклеткуиизбегаявлияниягуморальныхиммунныхмеханизмовхозяина.

ПРИНЦИПЫДИАГНОСТИКИВИРУСНЫХИНФЕКЦИЙ

1. Отборпатологическогоматериала.

2. Индикациявирусов.

3. Изоляциявирусов.

4. Идентификациявируса.

5. Ретроспективнаядиагностика

Диагностика играет важную роль в системе мероприятий по борьбе с болезнями животныхвирусной этиологии. Основным звеном в постановке диагноза являются результаты лабораторногоисследования, которые оформляют в виде экспертизы - официального документа, выдаваемого ве-теринарнымилабораториями.

Для постановки диагноза требуется сбор, изучение, анализ и сопоставление целого комплек-саразличныхданных.

Постановкадиагнозанавирусныеинфекциисостоитиздвухэтапов:

1. Предварительный диагноз - сначала используют данные, полученные непосредственно вхозяйстве – эпизоотологические данные (эпизоотическая ситуация в хозяйстве, вид и возраст жи-вотных, широта охвата болезнью, скорость распространения и территориальное распространениеболезни, летальность (%), сезонность, вакцинопрофилактика и др.), клинические признаки, пато-логоанатомическиеизменения.

2. Окончательный диагноз (лабораторный) - производится в ветеринарной лаборатории. За-висит от правильности взятия материала, его транспортировки, консервации, качества приготов-ления и техники исследования. Наиболее важна лабораторная диагностика, т.к. многие вирусныеболезни протекают схоже. Материал для исследований нужно брать как можно быстрее, исходя изпатогенезапредполагаемого заболевания.

Отбор патологического материала. Для проведения лабораторных исследований от боль-ных, павших или вынужденно убитых животных отбирают патологический материал с учетом па-тогенезапредполагаемойболезни(входныеворота,путидиссеминацииворганизме,органы-мишенирепродукциивируса, путивыделенияи клиническиепризнаки).

Патологическим материалом следует считать материал, полученный от больных или павшихживотных, в котором, предположительно, находится возбудитель (вирус), вызвавший заболевание,или антителакак результат иммунногоответа.

Патологическийматериалотбираютсучетомследующихправил:

• отборпроизводятотбольныхживотных-вострыйпериодболезнивразгарклинических

симптомов, от павших и вынужденно убитых - не позднее 1 - 2 ч с момента гибели или убоя(«правиловремени»);

• материал берут из тех органов, где развивался патологический процесс, с учетом тропизмавируса(«правиломеста»);

• соблюдают правила асептики и антисептики (используют одноразовый или стерильныйинструментарий, контейнеры с этикетками, на которых указывают вид материала и вид или ин-вентарный номер животного, растворы антибиотиков широкого спектра действия и противогриб-ковыхпрепаратов);

• материал доставляют в лабораторию с нарочным и сопроводительным письмом не позд-нее чем через 4 ч после отбора в термосе со льдом или хладагентом, (также для кусочков органов итканей можно использовать консервирующие растворы, например 50 % раствор глицерина на фи-зиологическом растворе). В сопроводительном письме указывают хозяйство, ферму или отделе-ние, вид животных, предварительный диагноз, вид и количество патологического материла, какиеисследования следует провести, дату и фамилию ветеринарного врача, направившего патологиче-ский материал. Патологический материал, доставленный в лабораторию, условно считают первич-ным, т.е. полученным непосредственно от больных или павших животных с подозрением на ви-руснуюболезнь.

От больных животных, подозрительных в заражении вирусом, отбирают следующие видыпатологическогоматериала:

• смывы, соскобы - берут ватно-марлевым тампоном или жестким одноразовым зондом сослизистых оболочек носа, конъюнктивы глаз, ротовой полости, задней стенки глотки, половых ор-ганов, прямой кишки, клоаки у птиц (например, при подозрении на вирусные пневмоэнтеритыКРС, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, грипп птиц и др.) и помещают во флакон с транс-портнойсредой(физиологическийраствор,pH7,0-7,2) сантибиотиками;

• пораженные участки кожи и слизистых оболочек (например, при подозрении на оспу -стенку папул или корочки, на ящур - стенку афт, на кожную форму чумы плотоядных - стенку па-пулилипустул);

• фекалии - непосредственно из прямой кишки (например, при подозрении на ротавирус-нуюиликоронавируснуюинфекцию);

• кровь цельную для выделения вируса (например, при подозрении на лейкоз крупного ро-гатогоскота);

• кровь для получения парных проб сыворотки крови для обнаружения и определения тит-ра антител - первую пробу берут в острый период болезни (в начале болезни), вторую - через двенедели (в период выздоровления), обе пробы исследуют в лаборатории одномоментно после дос-тавки второйпробы.

От трупов, подозрительных в заражении вирусом, отбирают кусочки патологического мате-риала(массой неболее 5-10г)из следующих органов и тканей:

• паренхиматозныхорганов(печень,селезенка,почки);

• региональныхлимфоузлов;

• измененныхоргановитканей;

• органов и тканей, в которых можно обнаружить вирус (например, при ИРТ КРС - абор-тированных плодов, плодных оболочек, при АЧС и КЧС - легких, при болезни Ауески и ньюкасл-скойболезни-головногомозга, при бешенстве-головуцеликом).

Лабораторную диагностику проводят в соответствии с методическими указаниями или на-ставлениями по диагностике конкретной вирусной болезни, утвержденными Департаментом вете-ринарии Минсельхоза России. В соответствии с ними на каждом этапе используют только опреде-ленные для каждой инфекции методы, диагностические наборы для которых выпускает биопро-мышленностьРоссии.

Патологический материал делят на две части: одну исследуют, другую замораживают и со-храняютнаслучай дополнительныхисследований.

Материалисследуютвсоответствиисэтапамилабораторнойдиагностикивирусныхболез-

ней:

• индикация(обнаружение)вирусавпатологическомматериале;

• изоляция(выделение)вирусаизпатологическогоматериала;

• идентификация(определениевида)выделенноговируса;

• ретроспективнаясеродиагностикапопарнымпробамсывороткикрови.

В случае если результат биопробы оказывается сомнительным (признаки репродукции виру-сов в тест-системе не характерны для предполагаемого вируса), то отбирают вторичный патологи-ческий материал от биопробы и с парными сыворотками определяют прирост титра антител вовторой пробе по сравнению с первой. Если титр антител увеличивается в четыре и более раз, этоозначает,чтовыделенныйвирусявляетсяэтиологическимфактороминфекционнойболезни, аэтапдиагностикиназываетсядоказательствомэтиологическойроли выделенноговируса.

2. Индикация вирусов. Экспресс-методы позволяют в патологическом материале обнару-житьследующиепризнаки наличияданного вируса:

• вирусныебелки(антигены)-всерологическихреакциях;

• вирусныенуклеиновыекислоты -вПЦР;

• вирионывирусов-методомэлектронной(длялюбыхвирусов)исветовой(тольковиру-сыоспы)вирусоскопии;

• активнуюформувируснойинфекционнойчастицы-методомбиопробынаживыхчувст-вительныхкпредполагаемомувирусутест-системах;

• тельца-включения-методомсветовоймикроскопии.

При положительном результате, полученном в ПЦР или серологических реакциях, вирусможетбытьужеидентифицирован идальнейшиеисследования непроводят.

Остальные методы позволяют только провести индикацию вируса, а для его идентификациилабораторныеисследования необходимопродолжить.

2. Выделение вируса. При отрицательном результате индикации проводят изоляцию (выде-ление) вируса методом биологической пробы. С этой целью суспензией патологического материа-ла, хранящегося в замороженном состоянии, заражают лабораторную живую тест-систему, чувст-вительную к предполагаемому вирусу (культуру клеток, куриные эмбрионы, лабораторных жи-вотных).

Выделение вируса из патматериала проводят на чувствительных тест-системах и очень редконаестественно-восприимчивыхживотных.

Выделение вирусов на естественно-восприимчивых животныхпроводится редко и толькодля воспроизведения типичных клинических признаков, характеризующих данную болезнь (ящур,чума КРС и свиней, оспа МРС и кур, ИНАН). Подозрительный на наличие вируса материал вводятс учетом тропизма естественно-восприимчивому животному, за которым ведут наблюдение. В пе-риодмаксимального развития болезни берутпатматериал.

Выделение вирусов на лабораторных животных. Чаще всего используют белых мышей, бе-лых крыс, золотистых хомячков, морских свинок и кроликов. Методы заражения различны, ночаще применяют в/м, п/к, в/бр, в/в, и/н и и/ц. Выбор метода заражения зависит от тропизма иссле-дуемого вируса и вида животного. После заражения за животными устанавливают контроль. Ма-териал для вирусологических исследований от таких животных берут как можно быстрее послепоявления четких специфических клинических признаков или после гибели. Признаками размно-жения вирусов в организме лабораторных животных служат клинические симптомы, гибель и па-тологоанатомические изменения. Для установления патологоанатомических изменений и одно-временно получения вируссодержащего материала для идентификации вируса зараженных живот-ных вскрывают. Использованных животных обезвреживают автоклавированием или сжиганием вспециальнопечи.

Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы чувствитель-ны к большинству вирусов птиц и к некоторым вирусам млекопитающих. Куриные эмбрионы ис-пользуют 5-12 дневного возраста. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого заро-дыша, на ХАО и амниотической, в стенках желточного мешка и т.д. Метод заражения куриногоэмбриона выбирают в зависимости от вида вируса и места введения материала. Признаки размно-жения вируса в куриных эмбрионах: гибель (устанавливают путем овоскопии), патологическиеизменения в зародыше или во внезародышевых оболочках (устанавливают на вскрытии) и нали-чиегемагглютининов (длягемагглютинирующихвирусов– РГА).

Выделение вирусов на культурах клеток. Это наиболее универсальная лабораторная системадляидентификациииизоляциивирусов.Лучшевыделятьвируспутемзаражениякультурклеток,

полученныхизоргановживотноготогожевида,откоторогобылвзятпатматериал,т.к.вирусвпат-материале уже адаптирован к клеткам определенного вида животных, можно надеяться получитьЦПД относительно быстро. Следует помнить, что характер ЦПД зависит не только от вируса, но иот типа клеток. Признаки размножения вирусов в культурах клеток различны: ЦПД, РГАд, бляш-кообразование,тельца-включения,РИФ,ИФА.Часторазмножающиесявкультурахклетоквирусывыходят в культуральную среду при разрушении клеток, которая и используется как готовая сус-пензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса,тоихразрушаютпутем2-3-хкратногозамораживанияиоттаиваниялибоультразвуком.

Часто при выделении вирусов из патматериала в первом пассаже тест-системы могут не да-ватьвидимойреакциинавирус.Этонеисключаетвозможностиприсутствиявирусависследуемомматериале.Этопроисходитпотому,чтовирусоказалсянедостаточноадаптированнымклаборатор-нойсистемеилиегоколичествонедостаточнодляпроявленияспецифическойреакции.Втакомслу-чаепервыйпассажсчитают«слепым»,иззараженныхлабораторныхсистемсобираютвируссодер-жащий материал и им заражают новую партию тех же лабораторных систем. Иногда только навосьмом пассаже вирус начинает проявлять свое специфическое действие, т.к. он к этому моментууже достаточно адаптировался к лабораторной системе и накопился в количестве, обеспечиваю-щем характерную для данной системы реакцию на вирус. Обычно же ведут 3-4 слепых пассажа.Для слепых пассажей используют ткани или органы соответствующие тропизму вируса, подозре-ваемоговинфекции.

2. Идентификация вируса. Выделенный вирус необходимо опознать, т.е. установить семей-ство, род, вид. Идентификацию неизвестного вируса проводят при помощи серологических реак-ций. Выделенный вирус используют как антиген и к нему добавляют известные специфическиесыворотки. Та сыворотка, с которой выделенный вирус даст положительную реакцию и укажет,какойэто вирус.

Выбор серологической реакции определяется тем, какая реакция наиболее пригодна для ра-боты с данным вирусом и определяется свойствами самого вируса. Так, если вирус проявил ге-магглютинирующие свойства, его идентификацию можно осуществить в РТГА, РНГА. Если вирусвыделяли на культурах клеток, и он проявил гемадсорбирующие свойства, естьсмысл идентифи-цироватьеговРГАд.

При отсутствии названных свойств у выделенного вируса надежно идентифицировать егоможно в РН на том лабораторном объекте, на котором он был обнаружен. Можно воспользоватьсяРСК и РДП при наличии в лаборатории соответствующих диагностикумов. Но наиболее универ-сальна РН. Она позволяет обнаруживать вируснейтрализующие антитела, которые создают в орга-низме защиту против вирусов. Считается, что нарастание титра антител во второй сыворотке посравнению с первой в 4 раза и более свидетельствует об активном инфекционном процессе в пери-од взятия у него крови. При этом болезнь была вызвана тем возбудителем, к которому были най-деныантителавпарныхсыворотках.

2. Ретроспективная диагностика. Если нет возможности провести индикацию и иденти-фикацию вируса, то решающее значение в лабораторной диагностике вирусных болезней имеетисследование парных проб сыворотки крови в серологических реакциях - ретроспективная серо-диагностика.

Парные пробы сыворотки крови получают от каждого больного животного дважды.Сэтойцелью кровь отбирают с интервалом 2 - 3 недели в начале заболевания (в острой фазе) и в конце (впериоде выздоровления). До исследования пробы сыворотки хранят в замороженном состоянии иисследуютодномоментно.

Задача ретроспективной серодиагностики сводится к определению в парных пробах сыво-ротки титра антител к вирусам, которые могли быть возбудителями болезни в соответствии спредварительным диагнозом. Если во второй пробе сыворотки титр антител в четыре и более развыше,чемвпервой,этосвидетельствуетобактивноминфекционномпроцессе,протекающемв

организме животного в период взятия у него крови, т.е. болезнь была вызвана тем возбудителем, ккоторомубылоустановлено повышениетитраантителвпарныхпробахсыворотки.

Идентификация возбудителя по парным пробам сывороток является достоверной в диагно-стике вирусных болезней. Однако ее ретроспективность (т. е. диагноз устанавливается оконча-тельно,когдаживотные ужеклиническивыздоровели или пали)являетсянедостатком.

Схемалабораторногоисследованиявируссодержащегоматериала

1. Индикациявирусавпатматериале

Эксперсс-методы:

1. обнаружениевирионов(электроннаяисветоваямикроскопия);

2. обнаружениевирусныхантигенов(РИФ,ИФА,РСК,РДП,РНГА);

3. обнаружениетелец-включений(световаяилюминесцентнаямикроскопия);

4. обнаружениевирусныхнуклеиновыхкислот(ПЦР,ДНК-зонды);

5. обнаружениегемагглютининоввРГА;

6. обнаружениеинфекционнойактивностивируса(биопробанатест-объектах).

2. Изоляциявирусаизпатматериала

путембиопробы(ЛЖ,КЭ, КК)

3. Идентификациявыделенноговируса

РН, РТГА, РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА и др. В реакциях антиген - выделенный вирус, анти-тело– специфическая сыворотка.

4. Доказательствоэтиологическойроливыделенноговируса

РН, РТГА, РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА и др. В реакциях антиген - выделенный вирус, анти-тело – в парных сыворотках крови. При увеличении титра антител во вторых пробах крови в 4 разапосравнению спервыми-положительныйрезультат.

5. Ретроспективнаядиагностика

Исследование парных сывороток крови в серологических реакциях: РН, РТГА, РИФ, ИФА,РСК, РДП, РНГА и др. В реакциях антиген – стандартные эталонные антигены, антитела – парныесыворотки крови. При увеличении титра антител во вторых пробах крови в 4 раза и более по срав-нениюспервымииувеличениесеропозитивных животных-положительныйрезультат.

2