Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

венные, в процессах метаболизма. Значительная часть продуктов биосинтеза после экскреции из клеток накапливается в среде. Некоторые промежуточные метаболиты служат резервным питательным фондом, которым клетка пользуется после истощения основных источников питания. Указывается, что экзогенный вератровый спирт может служить стимулятором лигнолитической активности дереворазрушающих базидиомицетов, однако, в свою очередь, он представляет собой продукт распада лигнина (Решет-

никова, 1997).

Исследования последних десятилетий обозначили несколько направлений, связанных с использованием экзогенных низкомолекулярных соединений в практике работы с культурами базидиальных макромицетов. Из них наиболее существенными и близкими к тематике наших исследований являются разработки, связанные с использованием соединений селена. Также интерес представляют возможности применения полиенового макролида нистатина в качестве инструмента селекционной работы и скрининга штаммов с определенными физиологическими особенностями.

Селен обладает выраженными антиоксидантными свойствами, так как является компонентом фермента глутатионпероксидазы, которая предохраняет мембраны клеток от окислитель-

ной деструкции (Scroeder et al., 1970; Levander, 1986, Rezanka, Sigler, 2008). В ряде источников на соединения селена – селенаты - указывают как на антиметаболиты (Birkett, Rowlands, 1981). Однако известно, что микроскопическими грибами синтезируются селеноорганические соединения. Так, в экспериментах, описанных в монографии, посвященной роли селена в живых организмах (Ковальский и др., 1971), бактерии, грибы и актиномицеты при культивировании на жидкой среде Чапека с добавлением селенита натрия синтезировали селеноэфиры и диалкилселениды. Отмечается влияние селена на синтез серусодержащих биомолекул, которые, в свою очередь, стимулирующе действуют на рост и споруляцию грибов (Негруцкий, 1990). Есть сведения, что селен служит для почвенных гифомицетов активатором ферментных систем (Мехтиева и Рабкрин, 1981). Концентрирование селена характерно для многих видов грибов (Ермаков и Ковальский, 1974). Проведенные нами исследования, направленные на реше-

70

ние вопроса о роли этого микроэлемента, показали, что вероятнее всего, селен необходим быстрорастущим организмам грибов как фактор, обеспечивающий высокие скорости роста (Денисова (Ильина) и др., 1997, 1999). Более высокая отзывчивость на добавление экзогенного селена у видов и штаммов, имеющих большие скорости роста, по сравнению с медленно растущими, доказана нами экспериментально (Денисова (Ильина), 1999). Быстрое деление клеток и активное накопление биомассы сопряжено с образованием кислородсодержащих свободных радикалов. Содержащие же селен ферменты обладают высокой антиоксидантной активностью (Ермаков, Ковальский, 1974).

Положение селена в Периодической системе между металлами и неметаллами делает селенопротеины идеальными катализаторами для многих биологических окислительновосстановительных превращений (Jacob et al., 2003). Хотя сера обладает химическими свойствами, сходными с селеном (Barceloux, 1999), одно из их отличий – химия окислительновосстановительных процессов, что позволяет селену действовать при гораздо более низких физиологических концентрациях, чем сера. Увеличивается число экспериментальных подтверждений того, что роль соединений селена в биологических системах не сводится к антиоксидантной (детоксификация реакционноспособных кислородных частиц селеновыми соединениями в составе глутатионпероксидаз), а является более сложной благодаря множественным реакциям с клеточными тиольными группами (Blessing et al., 2004). Важно отметить, что мишенями восстанавливаемых соединений селена являются не только сами SHгруппы, но и комплексные соединения тяжелых металлов с тиолами, которые обычно считаются более устойчивыми в отношении редокс-

реакций (Bettger, 1993; Knoepfel et al., 1994). При выращивании базидиальных грибов в культуре выяснено, что из агарикоидных макромицетов наиболее отзывчивыми на внесение селеновых добавок в питательные среды являются представители семейств

Agaricaceae, Bolbitiaceae, Coprinaceae и Polyporaceae, менее от-

зывчивыми – Tricholomataceae (Денисова (Ильина), 1999). Гастероидные грибы, в основном, менее чувствительны к селену, чем агарикоидные. Среди них наиболее отзывчивы на внесение селе-

новых добавок Endoptychum agaricoides, Mycenastrum corium,

71

Phallus impudicus. Выявлена корреляция между скоростью роста мицелиальных культур и отзывчивостью на селеновые добавки; данная закономерность прослеживается и на уровне штаммов одного вида. Последнее подтверждает гипотезу о том, что селен спасает грибы от одного из губительных последствий их чрезвычайно высокой скорости роста - свободнорадикального стресса, являющегося неотвратимым последствием интенсивного обмена веществ (Ильин, 2001). Видимо, это и предопределяет природную целесообразность накопления грибами селена как средства адаптации к негативным последствиям собственного быстрого роста. Примечательно, что гастероидные грибы, являясь сильными концентраторами селена, не ускоряют роста вегетативного мицелия при его дополнительном воздействии. Не исключено, что этот микроэлемент необходим им на другом этапе жизненного цикла, а именно, при образовании базидиом и базидиоспор, по продуктивности которых гастероидные грибы превосходят все другие макромицеты (Денисова (Ильина), Сашенкова, 1998). Перспективы использования селена в практике культивирования грибов до конца не изучены, однако нами показаны возможности снижения окислительного стресса культур, увеличения сроков хранения культур без пассажей и стимуляции развития мицелия и плодовых тел путем внесения соединений селена в питательные среды (патенты РФ №213641, 1999; №2157848, 2000; №2185435, 2002).

Окислительный стресс рассматривается как главный механизм дезорганизации клеточного метаболизма (Челомин и др., 1998; Довженко и др., 2005; Терешина, 2005; Рахмакулова, 2008;

Schützendübel, Polle, 2002; Choundry, Panda, 2004). К активным формам кислорода (АФК) относят: супероксидный анионрадикал (О2•), гидроперекисный радикал (НО2·), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (ОН·), синглетный кислород (1О2), окись азота (NO·), алкоксильные (RO·) и перекисные (RO2·) радикалы, гипогалоиды (HOCl, HOBr, HOI) (Болдырев, 2001).

Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. В клетке, находящейся в нормальном состоянии, избыток активных форм кислорода устраняется многоуровневой системой антиоксидантной защиты (Болдырев, 2001). На первом уровне обеспечивается четырехэлектронное восстановление основной массы внутрикле-

72

точного O2 при участии цитохромоксидазы без высвобождения АФК. На втором уровне происходит ферментное удаление образовавшихся супероксидного анион-радикала и перекиси водорода. К этой группе ферментов помимо супероксиддисмутазы относят каталазу, а также различные виды пероксидазы, среди которых выделяют аскорбат-, глутатион- и гваяколпероксидазы, играющие важную роль в разрушении Н2О2. Эти ферменты часто объединяют в группу ферментативных антиоксидантов. Третий уровень обеспечивается наличием «ловушек» АФК – неферментативных антиоксидантов. К ним относят белки, способные связывать ионы металлов с переменной валентностью, которые участвуют в реакциях генерации АФК. В клетках базидиальных макромицетов к таким соединениям относят металлотионины, металлотионинподобные белки, а также глутатион (Collin-Hansen et al., 2007). Их уникальность состоит в том, что они не только связывают тяжелые металлы – инициаторы окислительного стресса, а также металлы, катализирующие образование АФК, но и, как соединения, содержащие большое число SH-групп, участвуют в инактивации самих АФК. Эффективным «перехватчиком» АФК является аскорбиновая кислота, инактивирующая широкий спектр АФК. На четвертом уровне в клетке происходит восстановление продуктов оксидативного стресса – гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот. Главная роль на этом уровне принадлежит ферменту глутатионпероксидазе, которая катализирует реакцию восстановления гидроперекисей с помощью глута-

тиона (Schützendübel et al., 2001).

Исследования, посвященные изучению явления окислительного стресса у ксилотрофных базидиомицетов, позволили установить, что быстрый рост мицелия, характерный для большинства видов, сопряжен с высокой скоростью образования АФК (Костычев, 2008). Есть сведения, что дереворазрушающие грибы продуцируют и секретируют АФК в субстрат. В этом случае они, наряду с ферментами участвуют в разрушении природных полимеров – лигнина и целлюлозы (Hammel et al., 1997). Исходя из этого, можно предположить, что в ходе эволюции антиоксидантные системы таких видов приобрели больший «запас прочности», чем у медленнорастущих видов других эколого-трофических групп, что позволяет, например, первым расти в присутствии таких

73

сильных индукторов окислительного стресса как тяжелые металлы без значительной дезорганизации клеточного метаболизма. Проведенные опыты показывают, что один из представителей группы ксилотрофов, F. velutipes, в состоянии металлиндуцированного окислительного стресса, ощутимого для представителей прочих эколого-трофических групп, способен к нормальному развитию. Что же касается оптимизации механизмов контроля уровня окислительного стресса, целесообразны исследования с изучением действия природных антиоксидантов, в частности, соединений селена, что описано выше.

В последние десятилетия накоплено множество сведений о синтезе базидиальными макромицетами биологически активных веществ липоидной природы. Примерами могут служить синтез каротиноидов Laetiporus sulphureus, грибами рода Ganoderma – тритерпенов (ганодеровые кислоты), обладающих антиаллергическим и гипохолестеринемическим действием (рис. 7) (Smith et al., 2002).

Рисунок 7 – Структура аппланоксидиковой кислоты, выделенной из Ganoderma applanatum (по Boh et al., 2000)

Для самых грибов подобные вещества могут играть роль регуляторов процессов жизнедеятельности, в том числе перехода к вторичному метаболизму и плодоношению. Химическая природа тритерпенов обладает значительным сходством с таким классом веществ как стероиды (рис. 8).

Последние можно рассматривать как частично деградированные тритерпены, утратившие несколько углеродных атомов. Таким образом, процессы метаболизма этих веществ, несомнен-

74

но, пересекаются, что позволяет предполагать наличие у тритерпенов роли своеобразного резерва для синтеза стероидов, в том числе эргостерина.

Рисунок 8 – Пространственная формула стероидов

Названный стерин является наиболее распространенным у грибов и входит в состав клеточных мембран. Эти компоненты мембран являются своеобразной биохимической мишенью для повреждающего действия полиеновых макролидов, в том числе и нистатина.

Нистатин представляет собой полиеновый антибиотик, который образует комплекс с холестерином (рис. 9а). Уже в первых работах, посвященных изучению механизма действия полиеновых антибиотиков на мембраны, он объяснялся их взаимодействием со стериновым компонентом мембран. Согласно существующим гипотезам, полиены образуют специфические комплексы со стеринами, функционирующие в качестве пор и изменяющие избирательную проницаемость клетки (De Kruijff, Demel, 1974). Через поры из клетки выходят низкомолекулярные вещества, в частности, ионы калия и аминокислоты (Galе et al., 1975). Диаметр нистатиновой поры составляет около 8 Ǻ. В существующей модели (Kleinberg, Finkelstein, 1984) от 8 до 10 молекул полиена образуют цилиндрическую структуру, в которой гидроксилированные сегменты каждой молекулы обращены внутрь, образуя заполненную водой пору (рис. 9 б)).

75

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Рисунок 10 – Структурная формула эргостерина

Стерины связываются с антибиотиками в соотношении 1:1. Все это дало основание предположить, что устойчивость некоторых штаммов к полиеновым антибиотикам обусловлена, прежде всего, изменениями стеринового компонента мембраны. В литературе имеются сведения об изменении состава стеринов в клетках дрожжей и мицелиальных грибов, которые приобрели устойчивость к полиенам как под действием мутагенов, так и в процессе адаптаций. Сообщается о трех типах изменений клеточных стеринов: снижение общего количества стеринов (до 20 раз ниже, чем в среднем для представителей вида) (Bulder, 1971); снижение количества эргостерина, что отмечалось для дрожжей (Bard, 1972); полное отсутствие эргостерина или замена его другими стериновыми компонентами (Вирина, 1975). Возможности практического применения последнего явления в практике грибоводства изучено С.И. Никитиным (2004) при изучении влияния нистатина на развитие Pleurotus ostreatus. Целью исследования было обнаружение штаммов вешенки, устойчивых к нистатину, то есть, как предполагал автор, имеющих измененный состав стеринов. Таким образом, работа представляла собой поиск возможностей получения и культивирования штаммов вешенки, бедных эргостерином, необходимым насекомым-вредителям, тем самым, отчасти решалась проблема негативного влияния микофагов. Однако, каких-либо существенных результатов автором получено не было: установлен лишь эффект торможения роста всех изученных культур и установлены наиболее токсичные концентрации полиена.

77

Однако существуют работы, которые содержат информацию об иных возможных механизмах полиенрезистентности, связанных с экскрецией части содержащихся в клетке стеринов в среду (Molzaki, Woods, 1972). Они связывают полиены на подступах в клетке. Кроме того, у некоторых дрожжей и мицелиальных грибов обнаружена идентичность стеринового спектра у ряда устойчивых мутантов с таковым у клеток дикого типа. Обнаружены также мутанты с повышенным содержанием эргостерина (Bard, 1972). Это объясняют следствием экранирования или переориентации мембранных сайтов, взаимодействующих с полиенами. Таким образом, нет единого мнения относительно механизмов полиенрезистентности, вероятно одновременное существование различных систем адаптации. Кроме того, информация о современных исследованиях, посвященных данному вопросу, встречается крайне редко, и ориентирована на несколько иные стороны проблемы стеринового обмена грибов. В то же время полиеновые макролиды, и в том числе нистатин, обладающие значительной токсичностью, в настоящее время ограничены в применении и теряют актуальность как терапевтические средства, что может служить одной из причин некоторого ослабления интереса к ним и с позиций фундаментальных исследований.

Аспекты устойчивости к полиеновым макролидам у высших базидиомицетов практически не изучены, хотя исследование модификаций стероидного обмена у этих организмов представляет определенный интерес.

Нам представилась логичной возможность преимущественного развития в присутствии нистатина тех видов или штаммов, которые характеризуются такими индивидуальными свойствами, как более интенсивный метаболизм стеринов. Такие предположения основаны на результатах анализа работ НИИ Антибиотиков (г. Пенза), проведенных в конце 80-х – начале 90-х годов и посвященных оптимизации биосинтеза антибиотика фузидина с помощью комплекса генетических и физиологических методов (Бартошевич, 1983; Беляева, 1984). В работах показано, что уровень продуктивной активности продуцентов антибиотиков стериновой природы находится в прямой зависимости от полиенустойчивости. Т.В.Беляевой (1984) проведена, в частности, оптимизация биосинтеза фузидиевой кислоты при использовании полиен-

78

резистентного штамма Fusidium coccineum. Биосинтез фузидиевой кислоты, как и всех стероидов, связан с изопреном, а структура молекулы типична для таковой у мишени для полиенов. В работе, посвященной изучению особенностей биосинтеза стеринов, в том числе эргостерина и фузидиевой кислоты клетками продуцентов под влиянием нистатина, показано, что нистатинрезистентные штаммы отличаются способностью к сверхсинтезу целевого продукта. Это свидетельствует о том, что нарушение биосинтеза эргостерина ведет к накоплению промежуточных продуктов, которые являются резервом для синтеза прочих стериновых компонентов. На наш взгляд, подобные положения служат достаточной основой для исследований полиенрезистентности у штаммов ксилотрофных базидиомицетов, которые являются продуцентами ценных метаболитов стериновой природы.

Таким образом, изучение возможностей использования низкомолекулярных соединений различной природы открывает определенные перспективы для разработки приемов регуляции ростовых и синтетических процессов у базидиомицетов в культуре и требует пристального внимания исследователей.

79