Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

L. sulphureus, F. fomentarius, F. hepatica) также развивались на агаре Чапека-Докса заметно медленнее, чем на других изученных субстратах. Штаммы факультативных сапротрофов (F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum и P. cinnabarinus) оказались наименее требовательными к субстрату. Высокие, относительно прочих трофических групп, средние скорости роста отмечены на всех изученных средах, но максимальные скорости роста штаммов факультативных сапротрофов зафиксированы на картофельноглюкозном агаре.

Анализ полученных результатов свидетельствует, что прослеживается тенденция связи между трофическими стратегиями видов в природе и их отношением к источникам углерода и азота в питательных средах. Результаты показывают, что все изученные виды, что наиболее ярко выражено у облигатных и факультативных паразитов, тяготеют к натуральным средам, то есть субстрату, характеризующемуся присутствием аминного азота. В то же время, штаммы факультативных сапротрофов, в целом менее требовательные к питательной среде. Они хорошо осваивают синтетические среды (в частности, с нитратным источником азота), но, в сравнении с прочими, предпочитают полисахариды (амилоза, амилопектин) картофельно-глюкозного агара. Такие отличия могут объясняться возможностью активизации ферментативных комплексов, которые, по сведениям литературы, максимальным разнообразием отличаются именно у сапротрофных организмов (Одум, 1986). Это свидетельствует о целесообразности исследований особенностей развития культур ксилотрофных базидиомицетов на субстратах, еще более различающихся составом и структурой.

Таким образом, даже с использованием наиболее традиционных питательных сред установлены отличия в темпах роста и развития у видов ксилотрофных базидиомицетов, имеющих разные трофические стратегии.

На общем фоне обращают на себя внимание относительно низкие скорости роста штаммов, принадлежащих к видам – облигатным паразитам, причем даже на оптимальной для данной группировки среде (сусло-агаре). Причем наблюдения показывают, что самым растянутым во времени этапом развития культуры является фаза адаптации (lag-фаза), продолжительность которой,

100

например у Sparassis crispa составляет несколько суток. На наш взгляд, относительно более полной реализации физиологического потенциала культур ксилотрофных базидиомицетов, прежде всего редких и ценных в биотехнологии видов, можно достичь использованием некоторых ростовых факторов, а также адаптогенов различной природы.

3.2 Использование веществ – адаптогенов для оптимизации развития мицелия редких и ценных

с позиций биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре

В качестве веществ, способных оказать стимулирующее и адаптогенное влияние на процессы онтогенеза мицелиальных культур изучены фолиевая кислота, ее предшественник – парааминобензойная кислота, а также соединения селена.

Фолиевая кислота, предшественником которой служит парааминобензойная кислота (ПАБК), участвует в переносе одноуглеродных радикалов, что может иметь немаловажное значение в процессе утилизации одноуглеродных групп субстрата культурой гриба. Нами изучено влияние фолиевой кислоты на рост и развитие культур ксилотрофных базидиомицетов, причем установлено некоторое стимулирующее воздействие. Однако низкая термоустойчивость фолиевой кислоты делает необходимым применение ультрафильтрации ее растворов перед внесением в питательные среды. С практических позиций это влечет за собой ряд затруднений. На этом фоне предшественник фолиевой кислоты, ПАБК, является более предпочтительным: это вещество термостабильно, то есть допустимо внесение его в питательные среды до стерилизации. Кроме того, есть данные, что многие микроорганизмы вообще не способны к утилизации готовой фолиевой кислоты из субстрата, но синтезируют ее de novo (Овчинников, 1987). В отношении макромицетов этот вопрос является малоизученным.

Нами изучено воздействие парааминобензойной кислоты на рост и развитие культур, в результате чего была установлена концентрация, позитивно влияющая на рост большинства культур – 0,005 г/л. Установлено, что ПАБК оказывает позитивное

101

влияние на темпы и характер развития мицелия большинства штаммов изученных видов.

Для установления эссенциальности ПАБК использовали ее токсический аналог – сульфаниламид. Известно, что сульфаниламид, в силу сходства химического строения с молекулой ПАБК, способен имитировать последнюю и включаться в соответствующие метаболические превращения. Это искажает, и, в конечном итоге, блокирует процесс синтеза фолиевой кислоты. Разумеется, такие события могут происходить у организмов синтезирующих фолиевую кислоту de novo (Овчинников, 1987).

В эксперимент были включены штаммы видов ксилотрофных базидиомицетов, различающихся трофическими стратегиями, скоростями роста, представляющие определенный интерес с позиций практической микологии, экологии и биотехнологии. Вещества вносили в питательную среду в одинаковой концентрации 0,005 г/л. О роли ПАБК судили на основании результатов исследований скорости и характера роста мицелия штаммов на средах с ПАБК, с добавлением сульфаниламида, и контрольным вариантом (КГА). Наблюдения проводились в течение 15 суток. На первых этапах развития мицелия в опытных и контрольных вариантах, скорость роста культур была практически одинаковой. Однако по истечении нескольких суток от начала развития в вариантах с добавлением сульфаниламида рост прекратился на фоне заметного увеличения скорости роста в варианте с ПАБК и постепенным замедлением в контрольных вариантах (рис. 14). Среды, содержащие ПАБК, были освоены полностью в первую очередь, в контрольных вариантах освоение субстрата было завершено несколько позднее (в среднем на 2-3 суток, в зависимости от штамма). Рост на среде, содержащей сульфаниламид, прекращался полностью на 4-7 сутки (у штаммов разных видов). При расчете средних скоростей роста в вариантах с сульфаниламидом промеры, сделанные в течение первых нескольких суток, обусловили довольно низкие, но превышающие нулевые показатели, результаты.

102

Рисунок 15 – Влияние ПАБК на скорость роста штаммов ксилотрофных базидиомицетов: ряд 1 – контроль (КГА); ряд 2 – опыт (КГА+ПАБК). Штаммы: I. obliquus: 1- IO-1, 2-IO-2, 3-IO-3; Ph. tremulae: 4-Pht-1, 5-Pht-2; 6- Pht-3; S. crispa: 7-AI-10; F.pinicola: 8-Fpi-1, 9-Fpi-2, 10- Fpi-3; L. sulphureus: 11-РD-99, 12-РD-01, 13-Аh-02; G. applanatum: 14-G-1, 15-G-2, 16-G-3; G.lucidum: 17-Gl-1, 18-Gl-3, 19-Gl-6; F.fomentarius: 20-AH-96, 21-Nic-02, 22-Lp-05; P.cinnabarinus: 23-PyC-1, 24-PyC-2, 25-PyC- 4; H. annosum: 26-Han-1, 27-Han-2, 28-Han-3; F. hepatica: 29-Fh-1, 30-Fh-1а, 31-Fh-5 (планки погрешно-

стей – ошибка средней, р<0,05)

Заметно, что наиболее позитивная реакция формируется у большинства штаммов видов, обладающих паразитной трофи-

кой (Ph. tremulae, S. crispa, H. annosum). Объяснение выявленной закономерности заключается в позитивном изменении динамики развития культур видов – паразитов на средах с ПАБК. В этой связи целесообразно рассмотрение особенностей динамики развития на указанных средах всех изученных видов. Низкие скорости роста культур паразитных видов на КГА отчасти фиксируют-

104

ся в результате затянутой фазы адаптации: до трех, а иногда до пяти начальных суток роста не отмечается вообще, что в итоге формирует низкое среднее значение. Таким образом, очевидно, что, не изменяя существенно темпов развития в целом, ПАБК сокращает продолжительность фазы адаптации к субстрату, что особенно ценно при культивировании видов с паразитическими стратегиями развития. Тенденция к сокращению фазы адаптации отмечена также для факультатив. Характерной чертой влияния изученного вещества на штаммы видов последних двух группировок, оказалось также и позитивное воздействие на ростовые показатели и на стадии логарифмического роста, а также на стадии стационарного роста (за исключением факультативных сапротрофов), когда доступные ресурсы субстрата (глюкоза) вбольшей степени исчерпаны. Полученные результаты косвенно свидетельствуют о стимуляции обменных процессов у факультативных сапротрофов, связанных с вовлечением в метаболизм труднодоступных источников углерода. Таким образом, целесообразность использования ПАБК в качестве компонента питательных сред (в концентрации 0,005 г/л) установлена для культур ксилотрофных базидиомицетов разных трофических групп. Полученные результаты подтверждают предположение о роли и месте ПАБК в метаболических процессах микроорганизмов, и, в частности, грибов, как эссенциального ростового фактора.

Микроэлемент селен, обладая выраженными антиоксидантными свойствами, играет особую роль в процессах жизнедеятельности клеток. Внутриклеточные антиоксиданты предупреждают окислительное повреждение полиненасыщенных жирных кислот в биологических мембранах посредством ограничения и обрыва радикальных цепных реакций перекисей липидов. Селен, как часть фермента глутатионпероксидазы, оказывает защитное действие при окислительном стрессе, катализируя распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов и, тем самым, прерывая переокислительную цепную реакцию свободных радикалов (Grossman and Wendel, 1983).

Предварительно нами изучено воздействие селена (на примере селената натрия) на рост и развитие культур базидиальных макромицетов различных трофических и таксономических групп (Денисова (Ильина), 1999). Была установлена стимулирующая

105

рост мицелия, оптимальная для большинства изученных культур, концентрация соединений селена (в пересчете на элемент) – 10-5- 10-6 /л питательной среды.

Для удобства сравнения результатов влияния соединений селена на рост мицелиальных культур нами была предложена единая безразмерная величина – «коэффициент отзывчивости» (КО). Эта величина представляет собой отношение значения ростового коэффициента мицелиальной культуры (РК), выросшей на обогащенной селеном питательной среде, к значению РК, отмеченному в контрольном варианте (Денисова (Ильина),1998). Так, если полученное отношение составляло величину, превышающую 1, то очевидно наличие стимуляции роста мицелия селеном. В том случае, когда полученное значение было чуть выше или равно 1, отмечалась слабо выраженная стимуляция или ее не отмечалось вовсе. Если же значение составляло величину менее 1, то это указывало на негативное воздействие добавки к среде на скорость роста мицелия. Пользуясь такой величиной, удобно сравнивать характер реакции мицелия разных штаммов, видов и родов грибов на внесение в питательную среду соединений селена. В ходе оценки результатов исследований этот показатель рассчитывали исходя из значений скорости роста культур на среде с содержанием селена 10-6 г/л.

В ходе работы установлено, что грибы различных трофических групп реагируют на обогащение питательной cреды соединениями селена не одинаково, при этом наиболее выраженной позитивной реакцией характеризуются именно ксилотрофы (Денисова (Ильина), 1998). Связи между таксономической принадлежностью вида и реакцией на внесение селена в среду не прослеживается. На общем фоне установлена следующая закономерность: быстрорастущие штаммы (имеющие ростовые коэффициенты, превышающие 50) демонстрируют более высокие коэффициенты отзывчивости (выше 1,3) на внесение селена в состав питательной среды. Медленнорастущие культуры имеют значения КО, близкие к единице. Корреляция между отзывчивостью мицелия на обогащение среды селеном и ростовыми особенностями той или иной культуры (конкретно, ее интенсивностью роста) прослеживается отчетливо (рис. 16).

106

Наличие высоких степеней отзывчивости у быстрорастущих культур вполне достоверно (степень корреляции 0,9674) и может быть объяснено их “заинтересованностью” в антиоксидантных свойствах селена. Быстрорастущим культурам свойственен интенсивный обмен веществ, а следовательно, и высокие уровни накапливающихся в процессе обменных реакций свободных радикалов.

Величина ростового коэффициента складывается в основном из показателей скорости роста. Исходя из такого предположения, можно заключить, что повышенные концентрации селена в питательной среде обеспечивают более комфортные условия для развития быстрорастущих культур, о чем можно судить по возрастанию скоростей роста.

Таким образом, цикл предварительных исследований, направленных на изучение влияния селена на рост и развитие базидиальных макромицетов, показал, что вероятнее всего названный элемент необходим быстрорастущим организмам грибов как один из факторов, обеспечивающих их высокие скорости роста (Денисова (Ильина) и др., 1997). Быстрое деление клеток и активное накопление биомассы сопряжено с образованием кисло-

107

родсодержащих свободных радикалов. От их повреждающего действия могут в определенной степени предохранять селенсодержащие аминокислоты и специфические ферментные системы.

Полученные результаты обусловили целесообразность продолжения исследований в этом ключе применительно к группе ксилотрофных базидиомицетов. На данном этапе представляло интерес изучение влияния не только неорганических, но и органических соединений селена на рост и развитие штаммов с различными эколого-трофическими стратегиями. В качестве селенсодержащих добавок изучены: селенат натрия (Na2SeO4) и 9- фенил-симметричный-октагидроселеноксантен (селенопиран, СП-1). Селенопиран – органическое, низкомолекулярное гетероциклическое соединение, содержащее 24% селена, и обладающее низкой токсичностью (в 77 раз меньшей, чем неорганические соединения). Соединения вносили в среду в концентрациях 10-6 г/л

впересчете на селен.

Внаших исследованиях изучено воздействие селената натрия и селенопирана на среднюю скорость и динамику роста культур ксилотрофных базидиомицетов, относящихся к различным эко-

L. sulphureus, F. fomentarius, F. hepatica (факультативные паразиты); F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum и P. cinnabarinus (фа-

культативные сапротрофы). В данный набор видов входят как ценные с позиций сохранения биоразнообразия, редкие и занесенные в Красную Книгу РФ виды (S. crispa, G. lucidum), так и представляющие определенный интерес с позиций биотехноло-

гии (I. obliquus, L. sulphureus, G. applanatum, G. lucidum). Кроме того, в эксперименте представлены быстрорастущие культуры

(отдельные штаммы F. fomentarius, F. hepatica, G. applanatum, G. lucidum), так и культуры с низкими скоростями роста (штаммы

Ph. tremulae, S. crispa, H. annosum).

Результаты проведенных исследований указывают на целесообразность использования изученных соединений в практике лабораторного культивирования штаммов ксилотрофных базидиомицетов (табл. 5).

108

Таблица 5 – Влияние соединений селена на средние скорости роста мицелия ксилотрофных базидиомицетов (КГА, 26ºС, повторность трехкратная, р>0,05)

Достоверность различий между группами установлена при помощи апостериорного непараметрического теста Дункана.

109