Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

Развитие полиенрезистентных штаммов P. ostreatus происходило несколько иначе, чем описанного выше вида G. lucidum. Прорастание всех штаммов отмечалось в значительно более поздние сроки от момента инокуляции. Кроме того, морфологически отмечались две стратегии развития. Часть культур характеризовалась исключительно медленным ростом, колонии имели неровные края, радиальные круги и белесый оттенок мицелия; другие, составляющие большую часть, имели относительно более высокие темпы роста, насыщенный белый цвет (рис. 25). Воздушный мицелий, по сравнению с контролем, был слабо выражен у всех полиенрезистентных штаммов вешенки. Таким образом, получено пять устойчивых к действию нистатина штаммов P. ostreatus

(Pl-ун1, Plун2, Pl-ун3, Pl-ун4, Pl-ун5).

а) б) в)

Рисунок 25 – Морфология колоний различных штаммов

P. ostreatus: а) полиенчувствительный штамм ПН10 (тканевый изолят); б) полиенрезистентный штамм Pl-ун1; в) полиенрезистентный штамм Plун2

Эксперименты, проведенные с полиенчувствительными и полиенрезистентными штаммами P. ostreatus позволили обнаружить несколько иные, относительно G. lucidum, закономерности. Показатели содержания эргостерина у обычных, взятых из коллекции штаммов вешенки устричной, различались несущественно, и находились в среднем на уровне 0,409 мг%, что выше показателей, полученных для штаммов G. lucidum. Средние значения, рассчитанные для полиенрезистентных штаммов, в среднем, ниже, чем у обычных (полиенчувствительных), однако

130

такие результаты не являются достоверными (Р>0,05). Действительно, среди полиенрезистентных штаммов P. ostreatus обнаружены как характеризующиеся очень высокими, так и пониженными, по сравнению с контрольными штаммами, показателями содержания эргостерина (табл. 11, рис. 26).

Таблица 11 – Показатели содержания эргостерина в мицелии различных штаммов P. ostreatus

*полиенрезистентные штаммы; прочие – полиенчувствительные

Полученные результаты свидетельствуют, что механизмы формирования резистентности к действию нистатина у штаммов P.ostreatus более разнообразны, чем у описанного выше вида, но также связаны с изменением продукции эргостерина. Впоследствии было установлено, что штаммы с повышенным содержанием эргостерина обладали наиболее выраженной склонностью к образованию примордиев, и, напротив, штаммы с пониженным его содержанием не обнаружили образования зачатков плодовых тел в обычные для вида сроки.

131

Это служит очередным подтверждением связи интенсивности синтеза эргостерина с процессами плодообразования у базидиомицетов (рис. 27).

а) полиенчувстви-тельный штамм ПН-10 (тканевый изолят); б) полиенрезистентный штамм Plун1; б) полиенрезистентный штамм Pl-ун2

Таким образом, изученные виды ксилотрофных базидиомицетов, являющиеся в свою очередь исключительно важными объектами биотехнологии, характеризуются разными стратегиями формирования устойчивости к экзогенному воздействиию поли-

132

енов. Установленные закономерности могут быть использованы при скрининге штаммов, перспективных продуцентов эргостерина, а также склонных к плодоношению в условиях культуры.

133

Глава 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ИСТОЧНИКОВ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЛИГНИНА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

6.1 Влияние различных по структуре комплексных источников целлюлозы и лигнина на рост и развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов

По мнению ряда авторов, лигнин, как компонент природного субстрата ксилотрофов, может влиять на морфогенез гриба в естественных условиях (Фенгел, 1988). Известно, что разнообразное сочетание ферментных комплексов у грибов, связано, в первую очередь, с экологическими особенностями последних, их трофической специализацией и является следствием длительной эволюции (Решетникова, 1997). В процессе микробиологического разложения субстратов, содержащих лигнин, образуются разнообразные соединения как фенольной, так и нефенольной природы, которые могут выполнять ростовые, индукторные, корригирующие и целый ряд прочих функций, влияющих на ход развития мицелия. Довольно сложно создать условия, приближенные к природным, в условиях культуры. Сведения, касающиеся значения разных форм лигнина в качестве трофического и регуляторного фактора для чистых культур, в настоящее время довольно ограничены. В грибоводстве широко используются твердые органические субстраты на основе опилок, однако, как показывает опыт, использование таких субстратов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Частичным решением этих проблемы может стать модификация питательного субстрата внесением лигноцеллюлозных компонентов; дериватизация таких источников путем метанолиза. Подобная информация способна пролить свет на некоторые малоизученные, частные стороны развития культур дереворазрушающих грибов, что, безусловно, раскроет новые возможности использования последних в биотехнологии.

В ходе исследований нами проведено изучение особенностей развития мицелиальных культур базидиальных макромице- тов-ксилотрофов на питательных средах, содержащих одинаковое количество целлюлозы, но формы лигнина с разной степенью

134

конденсации молекулы (экстрагированные системой полярных и неполярных растворителей нативные и метанолизные опилки древесины дуба). Интерес представляло исследование ростовых показателей и интенсивности метаболизма мицелиальных культур на субстратах, содержащих разные формы лигнина, причем одна из них была получена в ходе предварительной обработки (метанолиза). Метанолиз – предварительная подготовка лигнинсодержащего материала, позволяющая существенно увеличить в нем число доступных метоксильных групп и олигомерных фрагментов лигнина. Одновременно эта процедура способствует разрыхлению субстрата и частичному высвобождению целлюлозы из лигноцеллюлозных комплексов. В итоге были подготовлены к использованию две формы лигноцеллюлозных добавок. Содержание метоксильных групп в нативных опилках составляло 18,9 мг/г материала или 0,61 мМ/г; содержание метоксильных групп в опилках, подвергшихся метанолизу, было более, чем вдвое, выше и составляло 41,6 мг/г (1,32 мМ/г). Содержание холоцеллюлозы в образцах опилок (определялось методом кислотного гидролиза по Комарову (Оболенская, 1991)) было приблизительно на одном уровне и составляло от 78,7 до 81,6%.

В качестве предварительной серии опытов была произведена попытка культивирования штаммов видов, характеризующихся разными трофическими стратегиями в природе, в чашках Петри на стерильных экстрагированных дубовых опилках двух сортов: нативных и метанолизных. Поскольку определенное заранее содержание целлюлозы в обоих источниках было одинаковым, возможное влияние на развитие мицелия тех или иных культур могло быть обусловлено только различной структурой молекул лигнина. Никаких дополнительных источников питательных веществ в состав субстратов не входило. Исходный материал для получения обеих форм источников целлюлозы и лигнина имел идентичное происхождение, а перед использованием был измельчен на одинаковые фракции, что исключает возможные артефакты. Было отмечено развитие (разное по своей интенсивности) для всех изученных культур, независимо от того, на каком субстрате преимущественно развивается вид в природе и какой тип гнили вызывает. Вероятно, это стало возможным благодаря удалению экстрактивных веществ из древесины в ходе ее подго-

135

товки. Исходя из литературных данных, мы предполагаем, что в ходе экстрагирования происходит инактивация специфичных для данного вида древесины веществ, которые могут рассматриваться в качестве одного из факторов иммунитета растения (Фен-

гел, 1988).

Установлены возможности относительно активного развития на указанных субстратах даже тех видов, которые очень слабо развивались на агаризованных средах (глава 3). Это виды – облигатные паразиты Ph. tremulae, H. annosum. На экстрагированных дубовых опилках развиваются и виды, которые не встречаются в природе на древесине не только дуба (I. obliquus, Ph. tremulae, H. annosum), но и прочих лиственных пород (H. annosum) (табл. 12). Макроморфологические признаки мицелия изученных штаммов при культивировании на опилках, подготовленных различным образом, существенно отличались. Мицелий, растущий на опилках, подвергшихся метанолизу, в большинстве случаев характеризовался высокой плотностью, был лучше выражен воздушный мицелий, хотя темпы роста нередко были ниже, чем в альтернативном варианте. Относительно низкие скорости роста можно объяснить более высокой концентрацией фенольных соединений в материале метанолизных опилок, чем в материале нативных. В высокой концентрации они могут оказать токсическое действие и ингибировать рост культуры. В вариантах с использованием нативных опилок мицелий был рыхловатый, паутинистый, воздушный мицелий не был выражен. Исключение составили штаммы – представители двух изученных видов:

L. sulphureus и P. cinnabarinus. У штаммов названных видов, на-

против, формировался относительно более густой мицелий на нативных опилках и более слабый, тонкотяжистый – на метанолизных.

Анализ и обобщение данных, полученных при изучении роста на опилках всех изученных штаммов каждого вида, показал, что виды, склонные к сапротрофности (факультативные сапротрофы) в подавляющем большинстве активнее осваивают метанолизный субстрат.

136

Таблица 12 – Средние скорости роста мицелия штаммов изученных видов на стерильных дубовых опилках в качестве субстрата (мм/сут, 26ºС, повторность трехкратная*)

*р<0,05

137

Это достоверно отмечено для F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum, в значительно меньшей степени (в пределах ошибки опыта) – для P. cinnabarinus. Группировка биотрофных видов

H. annosum), напротив, лучше развивались на нативных опилках

(рис. 28).

Вероятно, сапротрофные виды эволюционно адаптированы к эффективному использованию обилия метоксильных групп в значительной степени разрушенной древесины. Это косвенно свидетельствует о стимуляции метоксильными группами ферментативной активности мицелия наиболее перспективных в этом плане видов. Для более конкретного ответа на вопрос о механизмах активизации роста мицелия штаммов факультативных сапротрофов, необходимо изучение некоторых физиологобиохимических аспектов развития мицелия на средах, содержащих метоксильные группы лигнина.

Нативные опилки Метанолизные опилки

Рисунок 28 – Сравнительная оценка средних скоростей роста видов ксилотрофных базидиомицетов на различных субстратах (среднее по трем штаммам каждого вида, три повторности, 26ºС) (планки погрешностей – ошибка средней, р<0,05)

138

С другой стороны, с установлением возможности достаточно активного роста мицелия изученных видов на материале экстрагированных опилок, нельзя не отметить, что скорости роста штаммов всех видов в этом случае ниже средних скоростей, установленных для них на агаризованных средах. На наш взгляд, это объясняется удлинением лаг-фаз в условиях отсутствия легкодоступных сахаров и лимитированным количеством влаги в субстрате. Поэтому, для более полного раскрытия ростового потенциала штаммов в культуре целесообразно внесение некоторого количества метанолизных и нативных опилок в агаризованные среды.

6.2 Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании

Изучение активности ферментов ксилотрофных базидиомицетов проводилось при твердофазном культивировании на двух субстратах. В качестве субстратов выступали экстрагированные нативные и метанолизные дубовые опилки, пропитанные солевым раствором Чапека. Известно, что недостаток в среде легкодоступных источников углерода способствует выработке гидролитических ферментов (Решетникова, 1997). Определение ферментативной активности проводилось на 13-16 сутки роста мицелия, в момент наступления идио-фазы, о котором судили по косвенным визуальным признакам (появление капель экссудата, пигментирование). У многих видов, по сведениям некоторых авторов, в этот период отмечаются максимумы ферментативной активности.

Под общей оксидазной активностью понимают способность комплекса ферментов катализировать окисление фенольных структур лигнина при помощи молекулярного кислорода воздуха. К группе оксидазных ферментов относят лакказу, тирозиназу, а также их различные изоформы, так называемые фенолоксидазы. Такие ферменты как лакказы обладают достаточно широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление различных органических и неорганических субстратов, а при помощи различных редокс-медиаторных агентов лакказы

139