Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

способны окислять нефенольные органические соединения различной природы (Королёва, 2006).

Изученные виды грибов обнаружили различные уровни оксидазной активности в ходе развития на нативном и метанолизном субстратах (рис. 29).

Рис. 29 – Общая оксидазная активность изучаемых грибов на различных субстратах. Субстраты: Н – нативный, М – метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей – ошибка средней,

р<0,05)

Как видно на рис. 27, при культивировании на метанолизных опилках, по сравнению с нативными, достоверно снижается

общей оксидазной активности у названных видов грибов, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата. Такое явление можно объяснить тем, что Ph. tremulae

и H. annosum являются паразитами, а L. sulphureus и F. hepatica,

как факультативные биотрофы, способны колонизировать живые деревья и нормально существовать в таком состоянии длительное время. Таким образом, все четыре вида являются биотрофами. Кроме того, эти виды достаточно узко специализированы к породам деревьев. Вероятно, повышенное содержание более доступных фенольных компонентов лигнина в модифицированных опилках, подобно содержанию их в фаутной древесине, ингибирует у них выработку оксидазных ферментов. Это, возможно,

140

иявляется одной из причин приуроченности этой группы грибов к живым деревьям, древесина которых на начальных этапах колонизации имеет, небольшое, по сравнению с фаутной, содержание мономерных фенольных структур (Фенгел, 1978).

Напротив, такие виды грибов как F. pinicola, G. applanatum

иF. fomentarius демонстрируют более выраженную общую оксидазную активность на метанолизном субстрате, чем на нативном. Эти виды характеризуются более широкой трофической специализацией (т.е. способные проявлять себя в естественных место-

обитаниях, в равной степени, как факультативные биотрофы и сапротрофы, причем первые два в районе исследований – факультативные сапротрофы). Одновременно названные виды являются эвритрофными по отношению к породам деревьев. Увеличение оксидазной активности у этих видов грибов на субстрате с более доступными фенольными компонентами лигнина, может свидетельствовать о выработке у них индуцибельных форм оксидазных ферментов. Кроме того, вероятно, метанолизный субстрат может содержать разнообразные фенольные компоненты, такие как сирингалдазин, гваякол, пирокатехин и другие, являющиеся индукторами биосинтеза ферментов, в частности лакказ (Горба-

това, 2007).

Стенотрофные виды, приуроченные к ограниченному числу пород деревьев, среди которых встречаются факультативные паразиты (I. obliquus) и факультативные сапротрофы (P. cinnabarinus), показали недостоверные отличия оксидазной активности при росте на нативном и метанолизном субстратах.

Помимо оксидазной активности также была изучена пероксидазная активность ряда культур – представителей изученных видов ксилотрофных базидиомицетов. Под общей пероксидазной активностью понимают общую активность ферментов, катализирующих окисление молекулы лигнина, его фенольных компонентов (мономеров, димеров, олигомеров), а также нефенольных субстратов в присутствии перекиси водорода. В систему пероксидазных ферментов могут входить такие ферменты как лигнинпероксидаза, Мn-зависимая пероксидаза, некоторые исследователи сюда относят собственно пероксидазу (Решетникова, 1997).

141

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Средняя (по трем штаммам) пероксидазная активность изученных видов ксилотрофных базидиомицетов неоднозначна (рис. 30).

виды

Рисунок 30 – Общая пероксидазная активность изучаемых грибов на различных субстратах. Субстраты: Н – нативный, М – метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей – ошибка средней, р<0,05)

Установлено, что при развитии на нативном субстрате все виды грибов обладают в разной степени выраженной пероксидазной активностью. Наибольшие значения характерны для возбудителей белой гнили как (Ph. tremulae, G. applanatum) и активной смешанной гнили (F. fomentarius), и составляют, соответственно, 2,64; 1,75 и 1,80 ед.оп.пл.*100/г*сек. Возбудители белой гнили I. obliquus и P. cinnabarinus при развитии на нативных опилках проявили относительно слабые уровни пероксидазной активности, которые оказались близки к значениям, полученным для представителей бурой гнили (F. pinicola, L. sulphureus), которые варьировали от 0,13 до 0,53 ед.оп.пл.*100/г*сек. При развитии на метанолизном субстрате, такие виды как I. obliquus, G. applanatum и F. fomentarius продемонстрировали рост пероксидазной активности, соответственно, в 11,0; 2,3 и 1,6 раза, что, как и в случае с оксидазной активностью, может говорить о наличии индуцибельных форм пероксидазных ферментов, вырабатываемых рассматриваемой группой. Все возбудители бурой

142

гнили, а также некоторые представители белой (G. lucidum, P. cinnabarinus) при культивировании на метанолизных опилках показали полное снижение активности пероксидазных ферментов.

Также, наряду с исследованием активности лигнолитических ферментных систем, была определена активность целлюлазных ферментных систем изученных видов. О целлюлазной активности тех или иных видов грибов судили по утилизации целлюлозы в материале опилок и, косвенно, по концентрации глюкозы в вытяжке из субстрата, на котором проходило культивирование. Данные приемы целесообразны, поскольку опилки перед культивированием были подвергнуты водной экстракции до полного вымывания глюкозы и других водорастворимых сахаров. Таким образом, появление глюкозы в вытяжке из субстрата после культивирования свидетельствует о работе целлюлазных ферментов и утилизации полисахаридного комплекса древесины (Билай, 1982; Синицын, 1995). Данный метод отражает активность комплекса целлюлазных ферментов в совокупности.

Исследование содержания холоцеллюлозы в субстратах до и после ферментации (на 25 день) обнаружило, что все штаммы изучаемых видов грибов более или менее активно утилизировали этот материал (рис. 31).

Культивирование грибов – представителей деструктивной гнили

(H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica), на нативных опилках привело к потере холоцеллюлозы, соответственно, на 10,3 %; 13,7 %; 14,1 % и 15,9 %. Представители коррозионной гнили

(Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum) при росте на нативных опилках утилизировали, со-

ответственно, 1,7 %; 6,9 %; 5,9 %; 8,3 %; 8,1 %; 7,8 % целлюлозы.

Представители бурой деструктивной гнили активнее разрушают целлюлозу, чем представители белой коррозионной при росте на нативных опилках.

143

виды

Рисунок 31 – Утилизация из субстрата холоцеллюлозы штаммами изучаемых видов базидиомицетов. Субстраты: Н – нативный, М – метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей – ошибка средней, р<0,05)

Рост на метанолизных опилках сопровождался более интенсивным потреблением целлюлозы у таких видов как Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum

и H. annosum. Не установлено достоверных отличий в утилизации целлюлозы у L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica. Максимально, за

25 суток культивирования, деградировали целлюлозу, при росте на метанолизном субстрате, F. pinicola и G. lucidum (20,3 % и 19,6 %, соответственно).

Данные, полученные при изучении процесса утилизации целлюлозы, согласуются с результатами определения концентрации глюкозы в вытяжках из субстратов, что позволяет более объективно судить о целлюлазной активности изучаемых ксилотрофных базидиомицетов.

Установлено, что более или менее выраженной целлюлазной активностью при развитии на обоих типах субстратов обладали все изученные виды (рис. 32).

144

Рисунок 32 – Содержание глюкозы в вытяжке из различных типов субстрата: Н – нативный, М – метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов)

(планки погрешностей – ошибка средней, р<0,05)

Максимальные концентрации глюкозы, обнаруженные в вытяжках из нативного субстрата отмечены у видов грибов, вызывающих бурую деструктивную гниль (H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica), причем значения варьируют соответственно от 0,86 до 1,23 мМоль/л (см. рис. 65). Показатели содержания глюкозы в вытяжке из нативного субстрата при культивировании видов – представителей белой гнили (Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum) варьируют в пределах от 0,12 до 0,44 мМоль/л соответственно.

В целом, все виды изученных грибов, кроме F. hepatica, при культивировании на метанолизном субстрате, отличаются более высокой целлюлазной активностью по сравнению с таковой при развитии на нативных опилках. Согласно литературным данным, отдельные фенольные компоненты лигнина индуцируют выработку целлюлазных ферментов некоторых грибов (Muller, 1988), что подтверждается полученными нами результатами.

145

6.3 Штаммовые особенности ферментативной активности представителей грибов белой гнили на лигноцеллюлозном субстрате

Исследование ферментативной активности мицелиальных культур на лигноцеллюлозных субстратах наиболее актуально для грибов – представителей белой гнили, поскольку эта группа в основном обеспечивает делигнификацию природного субстрата. Предыдущая серия экспериментов позволила обнаружить связь между трофическими особенностями культур и реакцией их ферментативных систем на изменение структуры лигноцеллюлозного субстрата. Однако в ходе экспериментов обратили на себя внимание факты существования достоверных различий в показателях общей оксидазной и общей пероксидазной активности на уровне штаммов практически всех изученных видов грибов белой гнили, развивающихся на любом из изученных субстратов (как нативном, так и метанолизном), чего не отмечено для представителей бурой. В связи с этим, в эксперимент для выяснения возможных зависимостей были включены 15 видов грибов (по пять штаммов каждого), вызывающих белую коррозионную гниль древесины: C. perennis, I. obliquus, Ph. tremulae, G. applanatum, G. lucidum, B. adusta, F. fomentarius, L. betulina, L. warnieri, P. cinnabarinus, T. gibbosa, T. hirsuta, T. versicolor, H. annosum,

T.terrestris.

Вкачестве субстрата выступали экстрагированные нативные дубовые опилки, пропитанные солевым раствором Чапека. Данные, полученные при исследовании скоростей роста на лигноцеллюлозном субстрате, результаты определения общей оксидазной и общей пероксидазной активности штаммов были сопоставлены с их основными ростовыми характеристиками, зафиксированными на сусло-агаре. При анализе полученных данных обнаружена тесная корреляция ростовых показателей на агаризованных и твердофазных субстратах (r=0,76, р<0,05) (табл. 13). Это позволяет оперировать терминами «относительно быстрорастущие» и «относительно медленнорастущие» без дополнительных уточнений, не принимая во внимание характер субстрата.

146

Таблица 13 – Средние скорости роста (мм/сут) и ферментативная активность (ед.опт.пл.·100/г·с) разных штаммов некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов – возбудителей белой гнили древесины (*р<0,05)

147

Продолжение таблицы 13

148

Полученные результаты, свидетельствуют о существовании определенных зависимостей между скоростью роста мицелия и сторонами ферментативной активности штамма (рис. 33).

Рисунок 33 – Трехмерная проекция зависимости уровней общей оксидазной (ООА) и общей пероксидазной (ОПА) активностей штаммов от средних скоростей роста мицелия

Таким образом, быстрорастущие на агаризованных и твердофазных питательных субстратах штаммы грибов белой гнили, в среднем характеризуются более высокой общей пероксидазной, а медленнорастущие – более выраженной общей оксидазной активностью. Данную закономерность, с определенной долей вероятности (r=0,86 по оксидазной активности и r=0,30 – по пероксидазной), можно использовать в ходе скрининга штаммов – перспективных продуцентов ферментов.

149