Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

Видно, что дифференциация примордиев активнее происходила в варианте с метанолизными опилками. Дифференциация зачатков плодовых тел, формирование типичной для данных видов структуры гименофоров при развитии на таких средах были отмечены у видов F. fomentarius (штамм Nic-02), P. cinnabarinus (штамм PyC-1), S. commune (штамм SZ-2), P. aurivella (штамм

PhoA-5) (рис. 38-41). Причем названные виды наиболее четко из всех изученных продемонстрировали реакцию на присутствие в среде именно метанолизных опилок: ни в контроле, ни в варианте с нативными опилками в эти сроки образования примордиев с тенденцией к дифференциации не отмечено.

Рисунок 38 – Зачаток гименофора на мицелии F. fomentarius (штамм Nic-02), сформированный на среде с добавлением метанолизных опилок, 15 сутки

Рисунок 39 – Базидиома P. cinnabarinus (штамм PyC-1), сформированная на среде с добавлением метанолизных опилок, 20 сутки

162

ретал визуальных признаков старения (появление темного пигмента, капель экссудата, базофилии протоплазмы клеток при микроскопическом исследовании).

В первом варианте опыта (при добавлении к среде нативных опилок) установлено формирование примордиев, склонных к дифференциации (рис. 43). Они характеризовались типичной для базидиом G. lucidum структурой и окраской поверхности. Таким образом, заметна стимуляция плодообразования обогащением питательной среды нативными источниками целлюлозы и лигнина, которые в определенной степени могут играть роль регуляторов вторичного метаболизма, а, возможно, своеобразного триггерного фактора в процессе плодообразования.

Рисунок 42 – Примордии на мицелии G. lucidum (штамм Gl-1), сформированные на КГА (контроль), 25 сутки

Рисунок 43 – Примордий на мицелии G. lucidum (штамм Gl-1), сформированный на среде с добавлением нативных опилок, 25 сутки

Наши предположения нашли подтверждение в результатах второго варианта опытов (среда с добавлением метанолизных

164

опилок). Здесь процесс формирования зачатков плодовых тел в стерильных условиях шел более быстрыми темпами, причем уже на 15 сутки наметилась тенденция к дифференциации примордиев (рис. 44). К 20 суткам хранения вне холодильника сформировались миниатюрные базидиомы с зачатками гименофора, однако образования типичного плодового тела с развернутой шляпкой не было отмечено, возможно, по причине лимитированности трофических ресурсов.

Рисунок 44Дифференцированный примордий на мицелии

G. lucidum (штамм Gl-1), сформированный на среде с добавлением метанолизных опилок, 20 сутки

Следует отметить, что при обычном хранении вне настоящего эксперимента данный штамм G. lucidum не проявляет выраженной склонности к плодообразованию на агаризованных средах. Как уже указывалось, модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы (Фенгел, 1988). Опыты с меченым (14С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили (Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец. Таким образом, нет сомнения в том, что метоксильные группы небезраз-

165

личны для культуры G. lucidum, как типичного представителя грибов белой гнили.

Формирование дифференцированных примордиев в варианте с метанолизными опилками, обогащенными метоксильными группами, свидетельствует о том, что эти компоненты лигнина (концентрация которых заметно выше в древесине, уже подвергшейся процессам деструкции в природе) (Фенгел, 1988), могут служить факторами плодоношения не только в искусственных, но и в естественных условиях.

На основании полученных результатов представляется целесообразным исследование эффекта от использования таких компонентов субстрата при интенсивной технологии получения плодовых тел грибов, перспективных в биотехнологии.

166

Глава 7. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАЗИДИОМ И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ

НА ОСНОВЕ МИЦЕЛИЯ Ganoderma lucidum

7.1 Оригинальные рецептуры субстратов и технология получения плодовых тел Ganoderma lucidum

Все разработки, связанные с исследованиями возможностей получения стадии телеоморфы у грибов, перспективных в качестве продуцентов биологически активных веществ в лабораторных условиях, актуальны по нескольким причинам. Прежде всего, верификация вида продуцента возможна в основном при наличии плодового тела. Получение материала базидиомы дает возможность сравнения его химического состава и биохимических характеристик с таковыми у биомассы мицелия. Кроме того, половое спороношение в культуре обеспечивает получение спор

васептических условиях, а, следовательно, и новых штаммов спорового происхождения, для ведения селекционной работы.

Входе настоящих исследований использовались основные приемы интенсивной технологии выгонки плодовых тел на органических субстратах. Такая технология используется в практике грибоводства и позволяет в относительно короткие сроки (2-3 мес. от момента инокуляции) получить типичные плодовые тела культивируемых видов.

Разработанные нами субстраты были основаны на ржаной соломе. Сухая солома измельчалась до отрезков 2,0-4,0 см. Масса измельченного субстрата подвергалась кислотному гидролизу, об эффективности которого судили по убыли массы и совокупной концентрации сахаров в перколяте. Затем гидролизованная соломистая масса запаривалась и помещалась в термоустойчивые пластиковые пакеты, которые укупоривались ватно-марлевыми пробками и подвергались стерилизации. В опытах были изучены

вкачестве субстратов следующие композиции:

-гидролизованная солома – контроль;

-гидролизованная солома в смеси с экстрагированными нативными опилками (80%:20%) – первый вариант;

-гидролизованная солома в смеси с экстрагированными метанолизными опилками (80%:20%) – второй вариант.

167

Культуры осваивали различные субстраты с примерно одинаковой скоростью. Полное освоение объема субстрата происходило в среднем за 30 суток. После полного обрастания субстратов из пакетов были извлечены пробки, и пакеты были оставлены открытыми при комнатной температуре. Появление зачатков плодовых тел наблюдалось в разные сроки, но было отмечено во всех вариантах и в контроле. В контрольных вариантах дальнейшего развития базидиомы не происходило. Образовывались кожистые уплотнения, которые со временем приобретали бурую окраску. Мицелиальная корка высыхала и отторгалась от субстрата. В опытных вариантах на 38-45 сутки культивирования были отмечены тенденции к формированию плодовых тел. В частности, в варианте с нативными опилками на 42-45 сутки отмечено начало морфогенеза типичных базидиом. Развитие кожистых примордиев сливочного цвета происходило медленно, вскоре появилась типичная пигментация, на 55 сутки стало заметно образование гименофора, а на 60 началось высыпание зрелых базидиоспор. В вариантах с использованием метанолизных опилок все эти процессы протекали более интенсивно. Примордии, появившиеся на 38-40 сутки характеризовались более выраженной пигментацией, формирование типичных базидиом со зрелымии гименофорами во всех повторениях наблюдали к 55 суткам.

Показательно сравнение состояния базидиом, полученных при реализации первого и второго вариантов опытов на 55 сутки развития, когда базидиома, полученная на субстрате с метанолизными опилками, уже приступила к спороношению, а у выросшей на субстрате, содержащем нативные опилки, только началось формирование гименофора (рис. 45).

Таким образом, установлено позитивное влияние со стороны источников целлюлозы и лигнина (нативных и метанолизных опилок), включенных в состав субстрата на формирование телеоморфы G. lucidum в искусственных условиях. Отмечена достоверная стимуляция протекающих морфогенетических процессов. Присутствие опилок, обогащенных метоксильными группами, оказало наиболее заметное влияние. Таким образом, подтверждается наше предположение о том, что метоксильные группы могут служить фактором, стимулирующим переход культуры к вторич-

168

ному метаболизму, поскольку одной из иллюстраций этой фазы развития служит телеоморфа.

Рисунок 45 – Базидиомы G. lucidum, полученные в лабораторных условиях на субстратах разного состава (55 сутки развития с момента инокуляции субстратов): на переднем плане – субстрат содержит метанолизные опилки; на заднем плане – субстрат содержит нативные опилки

На основании полученных данных была разработана и запатентована рецептура субстрата, которая используется нами для получения плодовых тел G. lucidum. Безусловно, на процесс плодообразования в искусственной культуре влияет целый ряд внешних факторов, прежде всего микроклимат, однако определение оптимального субстрата представляется нам существенным моментом. Нами были получены зрелые телеоморфы всех изученных в настоящей работе штаммов G. lucidum, из базидиоспор которых (рис. 46) выращены моно- и дикариотические изоляты для коллекции мицелиальных культур.

169