Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

6.4 Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов

Выращивание мицелия в глубинных условиях традиционно рассматривается как наиболее приемлемый способ оценки характера развития культуры, в частности, степени накопления биомассы, под влиянием каких-либо факторов. Если в качестве таких факторов выступают добавки к питательной среде, одним из основных требований к ним служит их растворимость, поскольку в противном случае отделить глубинный мицелий (для определения его массы) от частиц, содержащихся в культуральной жидкости, будет практически невозможно. В наших экспериментах интерес представляло исследование влияния лигноцеллюлозных компонентов на процесс накопления биомассы мицелия в глубинных условиях. Поскольку опилки, как нерастворимый материал, при добавлении в жидкую питательную среду будут помехой для отделения биомассы мицелия, внесение их в обычном состоянии нецелесообразно для проведения данного эксперимента. На наш взгляд, частичным решением данной проблемы может служить предварительная перколяция лигноцеллюлозных субстратов. По литературным сведениям, в процессе перколяции до 40% материала древесины переходит в раствор (Грушников, 1973). Однако, используя таким образом подготовленный субстрат, невозможно будет судить о влиянии на развитие мицелия целлюлозы, а также гемицеллюлоз, которые в процессе перколяции разрушаются до олигомерных и мономерных компонентов (в основном, целлобиозы, глюкозы, ксилозы и т.д.). Таким образом, можно судить о влиянии со стороны метоксильных групп лигнанов, перешедших в раствор. Влияние же олигомерных и мономерных компонентов учесть сложно, но и исключить нельзя, поскольку их спектр (как качественный, так и количественный) чрезвычайно широк. В этой связи логичным представляется полное удаление углеводной составляющей из лигноцеллюлозного субстрата, то есть получение модельного лигнина (лигнина Классона) (Оболенская, 1991).

В наших экспериментах в качестве контрольной была использована модифицированная среда Чапека, содержащая 30 г/л

150

глюкозы (взамен сахарозы) и 3 г/л целлобиозы. Экспериментальные глубинные среды были приготовлены на основе экстрактов лигнинов Классона (перколятов), в которые было добавлено также 30 г/л глюкозы и 3 г/л целлобиозы. Два варианта лигнинов были получены удалением углеводов из исследованных лигноцеллюлозных материалов (нативных и метанолизных опилок). Полученные модельные лигнины подвергали кипячению на протяжении 48 ч. с целью получения водорастворимых фракций. Экстракты отфильтровывали от исходного материала и упаривали в ротационном испарителе до сухого остатка. Полученное сухое вещество анализировали на количественное содержание метоксильных групп. Результаты анализа продуктов перколяции представлены в таблице 14.

Таблица 14 – Содержание метоксильных групп в сухом остатке продуктов перколяции лигнина Классона, мМ/г

Исходный лигноцеллюлозный субстрат для получения лигнина Классона

Уравнивание концентраций сахаров в контрольном и опытных вариантах производилось в целях установления влияния на развитие мицелия именно метоксильных групп.

Одним из показателей метаболизма культуры может служить интенсивность синтеза эргостерина – основного грибного стерина, играющего ключевую роль в формировании структуры мембран, а также представляющего собой исходное вещество для синтеза многих продуктов стероидной природы, многие из которых рассматриваются как вторичные метаболиты (Smith et al, 2002). Интерес представляло изучение влияния метоксилированного лигнина на процесс синтеза эргостерина мицелием. В качестве исследуемого материала использовали биомассу воздушносухого мицелия, полученную в ходе глубинного культивирования на среде Чапека (контроль) и среде Чапека с добавлением перколятов нативного (первый вариант) и метанолизного лигнина Классона. У каждого из изученных видов для настоящего иссле-

151

дования были отобраны навески биомассы самых продуктивных штаммов (табл. 15).

Определение содержания эргостерина в мицелии проводили газохроматографическим методом с дериватизацией в триметилсилильные производные.

Результаты исследований показали, что содержание эргостерина выше в образцах мицелия, выращенного на средах с добавлением перколятов метанолизного лигнина, причем это достоверно отмечено для видов – представителей белой гнили (см. табл. 15), и, как исключение для представителя бурой гнили L. sulphureus. Стимуляция процессов образования эргостерина не обнаруживает достоверной корреляции с процессами стимуляции накопления биомассы мицелия: например, средняя биомасса I. obliquus (штамм IO-2), зафиксированная в опытах, почти не превосходила среднюю биомассу, накапливаемую культурой в контроле, а содержание эргостерина в опыте с экстрактом метанолизного лигнина увеличилось в 1,71 раза. Биомасса Ph. tremulae (штамм Pht-1) в аналогичном опыте была меньше контрольной в 1,40 раза, а содержание эргостерина – выше в 1,67 раза. Пропорционально увеличилось накопление биомассы и содержание эргостерина в опытных вариантах по сравнению с контролем у следующих видов: L. sulphureus (штамм РD-99), соответственно в 1,22 раза и в 1,30 раза; у G. applanatum (штамм G-2)

– в 1,47 раза и у F. fomentarius (штамм Nic-02) – в 1,33 и 1,32 раза соответственно увеличились оба показателя. Биомасса G. lucidum (штамм Gl-3) увеличилась в опыте по сравнению с контролем в 1,45 раза, а содержание эргостерина – в 1,31 раза.

152

Таблица 15 – Показатели содержания эргостерина (% от воз- душно-сухой массы) в воздушно-сухом мицелии штаммов исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная)

Примечание: результаты теста Дункана –a,b – маркировка групп по достоверным различиям в показателях биомассы; a*,b* - по содержанию эргостерина

. Интересный результат получен при оценке влияния метоксильных групп на изменение содержания эргостерина у P. cinnabarinus (штамм PyC-1): на фоне отсутствия достоверного влияния на накопление биомассы показатели содержания эрго-

153

стерина увеличились в 1,38 раза. Максимальное количество достоверных отличий в содержании эргостерина отмечено для опыта с использованием именно метанолизного лигнина, что свидетельствует о роли в реализации данного эффекта именно метоксильных групп.

Отсутствие прямой связи между процессами накопления биомассы мицелия и интенсивностью синтеза эргостерина в опыте и в контроле свидетельствует о том, что помимо затрат этого вещества на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза на его основе веществ и образования структур на последующих стадиях развития. Возможно, это резерв для синтеза вторичных метаболитов, связанных с протеканием репродуктивных процессов. В этой связи установленные закономерности предполагают исследование влияния изученных компонентов лигнина на процессы образования репродуктивных структур.

6.5 Влияние лигноцеллюлозных компонентов субстрата на процессы плодообразования у ксилотрофных

базидиомицетов в условиях чистой культуры

При культивировании штаммов наиболее перспективных с позиций биотехнологии видов, на материале опилок, были получены результаты, свидетельствующие о различной способности к развитию на таких средах штаммов видов с разными трофическими стратегиями в природе. Были сделаны предположения о негативном влиянии избытка метоксильных групп лигнина на штаммы видов с паразитическими стратегиями развития. В этой связи интерес представлял возможный эффект от внесения подобных материалов в качестве одного из компонентов в агаризованную среду. В эксперимент было отобрано по три штамма наиболее перспективных с различных позиций видов: I. obliquus, Ph. tremulae, S. crispa (представлен одним штаммом), F. pinicola, L. sulphureus, G. applanatum, G. lucidum, F. fomentarius, P. cinnabarinus, H. annosum, F. hepatica, F. velutipes, P. ostreatus, S. commune и Ph. aurivella. Предварительно проведенная серия экспериментов дала возможность установить оптимальные пропорции лигноцеллюлозных материалов в составе питательных сред. Оптимальное содержание нативных опилок в составе агари-

154

зованного субстрата составило 2-4% от массы среды, а для метанолизного материала – строго 2%.

Исходя из особенностей роста культур на средах, содержащих лигноцеллюлозные компоненты в установленных оптимальных концентрациях, можно судить о том, что именно метанолизные опилки в качестве компонента питательной среды, являются более доступным, чем материал нативных опилок, субстратом, поскольку выступают как фактор, положительно влияющий на развитие (табл. 16).

Таблица 16 – Скорость роста штаммов ксилотрофных базидиомицетов на плотных питательных средах с добавлением нативного и дериватизированного источников лигнина, 2% от массы среды (мм/сут±∆*, 26°С, повторность трехкратная)

155

Продолжениетаблицы16

*р>0,05

Примечание: результаты теста Дункана – a,b – маркировка групп по достоверным различиям в показателях

Полученные результаты могут объясняться тем, что при добавлении небольшого количества опилок в агаризованную среду, был создан «эффект разбавления», элиминирующий токсическое действие избытка метоксильных групп и олигомерных соединений лигнина, устранены такие лимитирующие развитие факторы как дефицит легкодоступных сахаров и влаги.

В первом варианте опыта (внесение опилок механического размола в КГА) существенных отличий от контроля (КГА) выявлено не было, хотя для отдельных штаммов установлена незначительная стимуляция роста. Во втором варианте (метанолизные

156

опилки, КГА) следует отметить факт достоверной стимуляции роста большинства штаммов, как видов – представителей бурой и белой гнили, так и представителей всех трофических стратегий.

I. obliquus, S. crispa.

Таким образом, на видовом уровне прослеживается разная степень стимуляции развития мицелия путем добавления к питательному субстрату источников целлюлозы и лигнина. Причем заметно, что в целях интенсификации роста культур целесообразно использование именно метанолизных опилок. Отдельного внимания заслуживает факт оптимизации роста видов-паразитов, обычно слабо развивающихся в культуре, посредством обогащения питательной среды лигноцеллюлозными компонентами в низких концентрациях.

Была исследована способность культур к формированию телеоморфы в стерильных условиях. Для этого культуры были отвиты по одному штамму каждого вида на скошенный картофель- но-глюкозный агар с добавлением нативных (первый вариант) и метанолизных опилок (второй вариант) в указанной выше концентрации, а в качестве контроля – на скошенный КГА без добавления опилок. Пробирки были помещены в условия холодильника на 5 суток, а затем извлечены из него и хранились при естественном освещении и комнатной температуре. По истечении 12-15 суток такого хранения у ряда культур было визуально отмечено формирование узелков примордиев (табл. 17). Образование зачатков плодовых тел наблюдалось в основном у грибов –

P. ostreatus, S. commune и P. aurivella). Исключение составил вид,

вызывающий бурую гниль древесины - S. crispa, для которого было отмечено образование плодовых тел. Появившиеся узелки на мицелии Ph. tremulae в вариантах с добавлением как нативных, так и метанолизных опилок, дальнейшее развитие прекрати-

P. ostreatus, S. commune и P. aurivella) на 20-25 сутки сформиро-

157

вались типичные примордии. В вариантах с метанолизными опилками, и, реже, в вариантах с нативными, у зачатков плодовых тел этих видов появлялась тенденция к дифференциации

(табл. 17).

Таблица 17 – Формирование зачатков плодовых тел на мицелии штаммов изученных видов ксилотрофных базидиомицетах на разных средах в стерильных условиях

* Обозначения: «-» - примордиев не отмечено; «+» отмечены зачаточные структуры примордиев (узелки); «д» - дифееренцированные примордии, заметен гименофор

158

Слабее всего была заметна дифференциация у примордиев

G. applanatum и S. crispa.

Формирование плотных остроконечных структур у G. applanatum из мицелиальных узелков произошло только на 25 сутки хранения и в вариантах с метанолизными опилками. Структуры были очень малы, имели столбчатую или шиповатую форму (рис. 34).

Рисунок 34 – Тенденция к дифференциации примордиев штамма G-1 G. applanatum на субстрате, обогащенном метанолизными источниками лигнина

Виды P. ostreatus, F. velutipes, склонные к формированию телеоморфы на стерильных средах, приступили к плодоношению в присутствии источников целлюлозы и лигнина в субстрате в более ранние сроки. Примордии на таких средах характеризовались, по сравнению с контрольными вариантами, более выраженными, типичными для видов габитусами, с хорошо выраженной дифференциацией (рис. 33, 34).

159