Занятие 3

Тема: Механизм действия ферментов и кинетика ферментативных реакций. Определение активности ферментов.

Актуальность. В современной биохимии широко применяют методы определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях. Это позволяет установить патогенез многих заболеваний и предложить методы их лечения с использованием современных лекарственных средств.

Цель. Уметь анализировать механизмы действия ферментов и кинетику ферментативных реакций. Ознакомиться с методами качественного и количественного определения активности ферментов в биологических объектах, которые позволяют не только изучить свойства ферментов и особенности их действия и регуляции, а также составляют основу диагноза и прогноза многих заболеваний. Ознакомиться с методом определения специфичности действия ферментов α-амилазы слюны и сахаразы дрожжей.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Современные положения о механизме действия ферментов: понятие об энергии активации реакции; образование фермент-субстратного комплекса и механизмы получения продуктов ферментативной реакции (ковалентный и кислотно-основный катализ). Значение работ Е. Фишера и Д. Кошленда.

2. Кинетика ферментативных реакций: влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции (графические зависимости). Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса, ее определение и значение.

3. Активность ферментов. Единицы измерения активности и количества ферментов: международные единицы, катал, удельная активность.

4. Факторы, которые влияют на активность ферментов: концентрация субстрата, фермента и продуктов реакции, температура, рН среды.

5. Методы выделения ферментов из биообъектов, их фракциониро-вание (ультрацентрифугирование, гель- и ионнообменная хроматография, аффинная хроматография, электрофорез) и анализ активности ферментов.

6. Методы определения активности ферментов: по количеству продукта, который образуется под действием фермента в единицу времени; по количеству израсходованного субстрата в единицу времени. Спектрофотометрические методы определения активности ферментов и визуализация результатов ферментативной реакции.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Константа Михаэлиса для фермента определяет:

А. Степень сродства фермента к продукту реакции.

В. Степень сродства фермента к субстрату.

С. Степень сродства фермента к ингибитору.

D. Среднюю скорость ферментативной реакции.

Е. Максимальную скорость ферментативной реакции.

2. Продолжите фразу «Незначительное изменение рН среды влияет на молекулу фермента, изменяя...»

А. Структурный уровень организации молекулы фермента.

В. Степень поляризации аминокислотных радикалов в активном центре

С. Толщину гидратной оболочки фермента.

D. Оптические свойства фермента.

Е. Биологическую функцию фермента.

3. Назовите показатель, который используют при определении удельной активности фермента, зная его общую активность:

А. Концентрация данного фермента в исследуемой пробе.

В. Концентрация белка в исследуемой пробе.

С. Концентрация субстрата в исследуемой пробе.

D. Константа Михаэлиса для данного фермента.

Е. Максимальная скорость исследуемой ферментативной реакции.

4. Назовите фамилию ученого, который предложил гипотезу «индуцированного соответствия».

А. Г. Кребс.

В. Д. Кошленд.

С. М. Ментен.

D. Ф. Крик.

Е. К. Функ.

5. Выберите фактор, который не влияет на значение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса.

А. Концентрация субстрата.

В. Химическая природа фермента.

С. Концентрация фермента.

D. Концентрация фермент-субстратного комплекса.

Е. Степень сродства фермента к субстрату.

6. В ходе ферментативного катализа при образовании фермент-субстратного комплекса:

А. Изменяется конформация субстрата

В. Изменяется конформация фермента

С. Устанавливается индуцированное комплементарное

соответствие между ферментом и субстратом

D. Сближаются функциональные группы, которые принимают

участие в катализе

7. Какое из перечисленных свойств ферментов лежит в основе их качественного и количественного определения в биологических объектах?

А. Способность проявлять максимальную активность при опреде- ленном значении рН среды.

В. Зависимость от присутствия в среде разнообразных актива- торов и ингибиторов.

С. Специфичность.

D. Термолабильность.

Е. Торможение реакции ее продуктами.

8. В пробирку с неизвестным субстратом добавили экстракт из дрожжей. После 15 мин инкубации смесь в пробирке дала положительную реакцию Фелинга. Какой субстрат был в пробирке?

А. Крахмал. В. Сахароза. С. Лактоза. D. Гликоген. Е. Целлюлоза.

9. Что лежит в основе механизма действия ферментов?

А. Сближение групп, которые входят в активный центр фермента.

В. Образование фермент-субстратного комплекса.

С. Изменение электрического заряда фермента.

D. Изменение пространственной конфигурации.

Е. Гидролиз фермента.

10. Укажите метод исследований, который используют для выделения ферментных систем отдельных субклеточных фракций из гомогената ткани.

А. Диализ. В. Изоэлектрическое фокусирование.	D. Дифференциальное центрифугирование.
С. Качественный анализ.	Е. Рентгеноструктурный анализ.

11. Назовите единицу активности фермента, которая определяется количеством фермента, превращающего 1 моль субстрата в 1 с при оптимальных условиях.

А. Катал.	D. Число оборотов.
В. Стандартная международная единица.	Е. Молярная активность.
С. Условная единица.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение специфичности действия ферментов α-амилазы слюны (α-1,4-глюканогидролазы; КФ 3.2.1.1) и сахаразы дрожжей (β-D-фруктофуранозидфруктогидролазы; КФ 3.1.1.26)

Задание 1. Приготовить экстракт из дрожжей, содержащий фермент сахаразу.

Ход работы. Растереть в ступке кусочек дрожжей с 10-15 мл дистиллированной воды и профильтровать.

Задание 2. Проверить действие амилазы на крахмал и на сахарозу.

Принцип. Об активности фермента судят по его действию на субстрат: по исчезновению субстрата или появлению продуктов. Расщепление крахмала обнаруживают по отрицательной реакции с реактивом Люголя. Расщепление сахарозы обнаруживают по положительной реакции с реактивом Фелинга, которую дают продукты гидролиза сахарозы (глюкоза и фруктоза), но не дает сахароза.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл слюны: в первую добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, во вторую – 3-5 мл 1% раствора сахарозы, перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в гидролизе крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в отсутствии гидролиза сахарозы.

Техника реакции Фелинга: к 1-2 мл исследуемого раствора добавляют равный объем реактива Фелинга (CuSО₄ + NaOH) и кипятят в пламени горелки. При наличии в растворе веществ моносахаридов выпадает осадок красного цвета (Сu₂О), образующийся в результате восстановления меди за счет окисления карбонильных групп моносахаридов.

Задание 3. Проверить действие сахаразы на крахмал и cахарозу.

Принцип: тот же.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл экстракта дрожжей; в первую добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, во вторую - 3-5 мл 1% раствора сахарозы, хорошо перемешивают и ставят в термостат при температуре 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в отсутствии гидролиза крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в наличии гидролиза сахарозы.

Оформление работы: заполнить таблицу.

№ пробирки

Фермент

Субстрат

Условия опыта

Результаты реакции

Выводы

Практическое значение. Ферменты, которые имеют абсолютную субстратную специфичность, используются в клинике как аналитические реагенты для определения веществ, являющихся их субстратами. Например, уреаза используется для определения мочевины в биологическом материале и лекарственных препаратах; глюкозооксидаза - для определения количества глюкозы в крови и моче. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью имеют меньшую избирательность действия на субстраты и, как правило, принимают участие в гидролизе питательных веществ или преобразовании чужеродных соединений. Например, α-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, имеющих место в данных углеводах.