Определение ферментов в биологических объектах. Изучение влияния температуры и рН среды на активность ферментов.

Задание 1. Выявить в слюне фермент α-амилазу, который гидролизует крахмал до дисахарида мальтозы и декстринов.

α-Амилаза слюны (α-1,4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1), имеет относительную групповую специфичность, расщепляет α-1,4-гликозид-ные связи в полисахаридах и не действует на дисахариды.

Принцип. Об активности фермента судят по его действию на субстрат: либо по исчезновению субстрата, либо по появлению продуктов. Расщепление крахмала обнаруживают по отрицательной реакции с реактивом Люголя.

Ход работы. В пробирку вносят 0,5-1 мл слюны, добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, перемешивают и ставят в термостат при 37⁰С на 15-20 мин. После этого в пробирку вносят 3-4 капли реактива Люголя (раствор J₂ в КJ).

Задание 2. Проверить термолабильность амилазы.

Принцип: тот же.

Ход работы. В пробирку вносят 0,5-1 мл слюны, добавляют 1 мл дистиллированной воды, кипятят в пламени горелки и охлаждают; затем добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. После этого в пробирку вносят 3-4 капли реактива Люголя.

Задание 3. Проверить влияние рН среды на активность амилазы.

Принцип: тот же.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл слюны; в первую добавляют 1 мл 0,4% раствора NaOH, во вторую - 1 мл 0,4% НС1; в обе пробирки добавляют по 3-5 мл 1% раствора крахмала и ставят в термостат при 37°С на 15-20 мин. Учитывая, что NaOH реагирует с J₂ (NaOH+J₂  NaJ+Н₂О), перед добавлением реактива Люголя в пробирку с NaOH вносят 1 мл 0,4% HCI для нейтрализации щелочи.

Оформление работы: заполнить таблицу

№ пробирки

Фермент

Субстрат

Условия опыта

Результаты реакции

Выводы

Практическое значение. Изучение общих свойств является необходимым для подбора оптимальных условий действия ферментов при определении их активности в научных и клинических исследованиях. Неверно подобранные стандартные условия приводят к ошибкам при диагностике заболеваний и контроле качества ферментативных препаратов.

Литература

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 86-89, 106.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 115-128, 137-138.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 66-78.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 109-117.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 114-129, 139-143.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 75-83.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 53-73.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 34-36.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-59.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 82-84.