3. Описать методику обнаружения бактериофага в исследуемом материале.

Обнаружение бактериофага в жид пит среде. 2 сосуда (пробирки или колбы) с пит средами засевают 1ой и той же культурой микроба, гомологич искомому фагу. Одновр с посевом или после 3–4-час инкубирования в термостате в 1 из сосудов (опытный) вносят фильтрат исслед материала. 2ой сосуд, содерж пит среду, засеянную культурой микробов, явл контролем. Оба сосуда ставят в термостат при 37°С и через 24 ч учитывают результаты. При учете результатов возможны следующие варианты:

· содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле – помутнение пит среды. Полученные данные указывают на содержание в исслед фильтрате бактериофага высокой активности; · в опытном сосуде имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды, что свидетельствует о содержании в исслед материале бактериофага средней активности; · при одинаковом помутнении в обоих сосудах для окончательного заключения об отсутст бактериофага необходимо дополнит исслед: высев на плот пит среду содержимого опытной и контрол пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 °С учитывают результаты. Посев из контрол сосуда дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исслед материале на фоне сплошного роста микробов появляются стерильные пятна – колонии бактериофага.

Обнаружение бактериофага на плот пит средах по методу Отто. Мясопептонный 1,5 % агар разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие негативных колоний бактериофага). Чашки с агаром, хорошо подсушенные, засевают 3–6-час бульон культурой или смывом с суточной агаровой культуры бак, гомологич искомому фагу. Для получения сплошного роста 2–3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают шпателем равномерно по всей ее площади или аккуратно распределяют бульон культуру (около 2 мл) по поверхности чашки, избыток удаляют пипеткой. Затем 30 – 40 мин подсушивают при 37°С, накрыв стерильным бумажным фильтром. На подсушенную поверхность посева наносят каплями исслед фильтрат. На 1ой чашке можно поставить несколько проб. Для этого по дну чашки намечают разделение пит среды на секторы и в каждый сектор вносят по калле фильтрата. После того как жидкость впитается в среду, чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при 37 °С на 18–24 ч. Учет результатов доказательством наличия бактериофага служит отсутст роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом участке мелких стерильных пятен – колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

4. Описать методику титрования бактериофага.

Титрование бактериофагов проводится с испол культур чувствит бак в жид и плот пит средах.

Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жид пит среде) Готовят 10кратные разведения исслед бактериофага в пит бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исслед фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответств разведения фага с уменьшением его концентрации в 10 раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9... Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бак. После инкубации в течение сут опред титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при кот наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа (на плот пит среде) Пит агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужид пит агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают 10кратные разведения исслед бактериофага в изотонич р-ре хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствит к бактериофагу бак и выливают эту смесь в пробирку с полужид агаром т 45°. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность 1ого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания 2ого слоя агара чашки инкубируют при 37° в теч сут. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 10(2)–10(10)., в зависимости от предполагаемого титра фага.

Не заражённые бактериофагом бак, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности пит агара. Каждая инфицированная бактериофагом бак лизируется и освобождает потомство бактериофага, кот внедряется в интактные кл бак, и весь цикл повторяется. В результате лизиса кл на сплошном бактериал газоне появл «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует кол-ву фаговых частиц в засеянной смеси. Кол-во пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.