29. Определение активности антибиотика методом диффузии в агар. Опишите методику посева и учета результатов

Метод основан на сравнении степени угнетения роста тест-микроба опред концентрациями а/б в испытуемом материале с угнетением его роста известными концентрациями стандарта а\б. Подавление роста тест-микроба осущ за счет диффузии а\б из исслед материала в плот среду. Рабочими стандартами служат спец изготовленные очищенные образцы а\б, активность кот уст по международным стандартным препаратам. Стандарты сохр в запаянных ампулах при т 4-100С. На этикетках ампул указано содержание единиц или микрограммов в 1 мг препарата.

Методом диффузии в агар можно опред концентрацию всех а\б, содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости) и в тк орг (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и др.).

Для опред концентрации а\б в сыворотке кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают и вносят в спец лунки, изготовленные в агаровых пластинках, либо разводят нормальной сывороткой чела или соответствующим каждому антибиотику буферным раствором.

1) Подготовка чашек со средами и тест-микробом. С этой целью можно испол чашки Петри с разлитыми в 1 или 2 слоя пит средами. При этом для нижнего слоя испол «голодные» незасеянные среды, для верхнего или 1го слоя агаровую среду засевают соответств тест–микробом. Обычно испол пит среды, приготовленные на бульоне Хоттингера. Каждому а\б соответствует среда с определенным содержанием аминного азота.

Среду, предназначенную для нижнего слоя, разливают в чашки Петри, кот располаг в горизонт плоскости, отрегулированной по ватерпасу. Нижний слой можно разливать заранее, сохраняя чашки при т 2-80С в теч 3-5 сут. Пит среду для верх слоя заражают взвесью соответствующего тест-микроба, кот имеет наибольшую чувствит к данному а\б. Аспорогенные культуры вносят в среду при т не выше 48-500С, взвесь спор при 65-700С. Посевная доза тест-микроба д б предварительно уст для каждой серии среды, т к увеличение плотности посева может сопровождаться образованием густого микробного «газона» и уменьшением размеров зон задержки роста тест-микроба, а при недостаточном кол-ве засеянного микробных кл не будет образования сплошного роста, что в дальнейшем затруднит измерение диаметра зоны подавления.

2) Приготовление рабочих р-ров стандарта а\б и испытуемого материала. Для приготовления р-ров стандарта а\б делают точную навеску на аналитич весах. Навеску растворяют в соответствующем р-ле расчёта 1 мг или 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор). Дальнейшее разведение основных р-ров доводят до нужных концентраций.

Для стандарта каждого а\б опред концентрацию р-ра, обеспечивающую образование оптимальных зон задержки тест-культуры (контрол концентрация). При приготовлении р-ров испытуемого материала нужно стремиться создать концентрации а\б в близких контрол концентрации стандарта пределах. Приготовленные разведения стандарта а\б и испытуемого материала вносят в стерильные цилиндрики из нержавеющей стали или алюминия, расставленные по 6 в чашке на поверхности застывшей пит среды. Вместо цилиндриков можно вносить испытуемые р-ры в предварительно сделанные в толще агара лунки диаметром 8 мм или пропитывать ими бумажные диски. Однако при испол дисков иногда получаются зоны неправильной величины и формы, что связано с неравномерной диффузией а\б из диска. Р-ры стандарта и испытуемого образца вносят в цилиндрики или лунки спец капельницей или пипеткой в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемый растворы. Для каждого испытания испол не менее 3-х чашек. Чашки инкубируют при 370С в теч 16 ч, затем измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба, образуемыми растворами.

3) Расчет активности испытуемого препарата. Концентрацию а\б в испытуемом субстрате определяют по стандартной кривой. Для построения стандартной кривой испол 5 концентраций стандартного препарата. 1 из концентраций, по кот вносят поправки для всех др, явл контрол. Для каждой концентрации, кроме контрольной, испол 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 цилиндрика или лунки каждой чашки вносят р-р контрольной концентрации, в 3 др – 1 из взятых концентраций стандарта. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на 3 чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрол концентрации на всех чашках (12х3 = 36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, опред из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она полож, и вычитают, если отрицательная.

Пример. Средняя величина зоны контрол концентрации 1 ЕД/мл равна 19,2 мл (выведена из 36 зон). Средняя величина зоны для той же концентрации, выведенная из 3 чашек, на кот испытывался р-р, соответствующий 0,8 ЕД/мл, равна 19 мм. Величина поправки составляет +0,2 мм. Средняя величина зоны для концентрации 0,8 ЕД/мл составляет 17,9 мм, после внесения поправки: 17,9 мм + 0,2 мм = 18,1 мм. Т о исправляют значение величин зон для остальных концентраций, используемых при построении стандартной кривой.

На полулогарифмической сетке расчёта активности а\б по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс величины зон против значений соответств концентраций на оси ординат. При постоянных условиях опыта стандартной кривой можно пользоваться длительно, проверяя угол наклона для каждой вновь приготовленной серии пит среды по 2-3 концентрациям стандарта на 3-5 чашках.

При опред концентрации а\б в сыворотке или др субстрате испытуемый субстрат разводят до предполагаемого ур, близкого к контрольной концентрации. В зависимости от кол-ва испытуемого материала применяют 1 или несколько чашек на каждое разведение. Параллельно с испытуемым материалом на каждую чашку вносят контрольную концентрацию стандарта а\б. После инкубации при 370С в течение 16-18 ч измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором.

Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответств найденной величине зоны в ЕД/мл. Умножая полученную концентрацию на степень разведения испытуемого материала, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода составляет ±10%.

При опред активности а\б методом диффузии в агар ответ получают через 16-18 ч. Существуют ускоренные методы опред, с помощью кот результаты можно уст уже через 3-5 часов. Ускорение опыта достигается путем увеличения посевной дозы тест-культуры на 1 мл пит среды, повышением т инкубации до 38-450С или проявлением плохо видимых зон и слабо выраженных микробных газонов через 3-5 часов инкубации химич методами. В последнем случае поверхность пит среды обрабатывают 2% р-ром красной кровяной соли и 1% р-ром железо - аммиачных квасцов. Микробный газон при этом окрашивается в темно-синий цвет, на фоне которого четко вырисовываются светлые зоны подавления роста.