6.3 Практическая часть

6.3.1 Опыт 1. Определение белка по методу Лоури

Определение белка по методу Лоури основано на комбинации биуретового метода (образование окрашенного комплекса пептидных связей с медью) и метода Фолина (образование окрашенного комплекса реактива Фолина с ароматическими аминокислотами).

Метод Лоури имеет ряд преимуществ в сравнении с двумя вышеуказанными методами. Биуретовый метод малочувствителен; окраска, развивающаяся при определении белка по методу Фолина, сильно зависит от аминокислотного состава белка. Комбинированный метод Лоури в 100 раз чувствительнее биуретовой реакции, и точность определений мало зависит от состава белка. Метод прост и удобен для серийных анализов.

Приборы и реактивы: пробирки; пипетки на 1 мл; пипетки на 5 мл; мерные цилиндры на 50 мл; фотоэлектроколориметр (ФЭК) с кюветами толщиной 1 см; 2%-ный раствор карбоната натрия в 0,1 М растворе гидроксида натрия (реактив А); 0,5%-ный раствор медного купороса в 1%-ном растворе сегнетовой соли (реактив Б); реактив Фолина, разбавленный водой; стандартный раствор кристаллического альбумина в воде (0,25 мг/л).

Реактив Фолина готовится следующим образом: 100 г Na₂WO₄*2H₂O и 25 г Na₂MoO₄*2H₂O растворяют в 700 мл воды, прибавляют 50 мл 85% H₃PO₄ и 100 мл концентрированной HCl. Смесь кипятят с обратным холодильником 10 часов, затем добавляют 150 г Li₂SO₄, 50 мл воды и несколько капель брома. Для удаления избытка брома смесь кипятят без холодильника. После охлаждения раствор фильтруют и хранят в темной склянке. Реактив Фолина титруют NaOH до перехода окраски по фенолфталеину и разбавляют водой, чтобы раствор имел 1Н кислотность (для этого реактив разбавляется примерно в 2 раза).

6.3.1.1 Методика выполнения работы

В пробирку приливают 0,4 мл испытуемого раствора белка и 2 мл реактива С (готовят приливая 50 мл реактива А к 1 мл реактива Б). Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина, очень быстро перемешивают (в течение 1-2 секунд) и оставляют на 30 –40 минут при комнатной температуре для развития краски. По истечение указанного времени интенсивность окраски образовавшегося комплекса измеряют на ФЭКе при красном светофильтре (λ=690 нм). Содержание белка определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочной кривой для определения белка по методу Лаури.

Для построения калибровочного графика готовят серию проб с точно известными концентрациями белка, используя исходный раствор стандартного белка (кристаллического сывороточного альбумина) с концентрацией 250 мкг/мл. Каждую пробу ставят в двух повторностях. Так, в первые две пробирки вносят по 0,2 мл стандартного раствора и 0,8 мл воды (общий объем 1 мл, концентрация белка – 50 мкг/мл). В последующие пары пробирок вносят 0,4; 0,6; 0,8; 1 мл раствора белка и, соответственно, 0,6; 0,4; 0,2; 0 мл воды. Концентрация белка в этих пробирках составляет соответственно 100; 150; 200 и 250 мкг/мл. Затем во все пробирки добавляют те же реактивы, что в пробирки с испытуемым раствором белка.

Во всех приготовленных растворах проводят определение оптической плотности относительно дистиллированной воды. Значения оптической плотности усредняют. На миллиметровой бумаге строят график, откладывая по оси абсцисс значения концентрации, а по оси ординат – соответствующие средние значения А. Полученный график должен иметь вид прямой линии, проходящей через начало координат. Для определения неизвестной концентрации белка на графике находят точку с ординатой, равной среднему значению экстинкции анализируемого раствора, и определяют ее абсциссу, то есть концентрацию белка.