Количественное определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по методу Иендрашика, Клеггорна и Гроффа

Задание 1. Определить содержание общего, связанного и свободного билирубина в сыворотке крови методом Иендрашика, Клеггорна и Гроффа.

Принцип. Метод базируется на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина образовывать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розово-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разности между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного.

Ход работы. В три пробирки вносят, в соответствии с таблицей, необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

Реактивы	Общий билирубин, мл	Связанный билирубин, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0,5	0,5	0,5
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
Раствор натрия хлорида	-	1,75	0,25
Диазореактив	0,25	0,25	-

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного - на 5-10 мин (при более продолжительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин). По окончании указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭК при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина отнимают экстикцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику. Свободный билирубин рассчитывают по разности между количеством общего и связанного. Рассчитывают содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и делают вывод о причинах возможных отклонений этих показателей.

Клинико-диагностическое значение. В норме содержание общего билирубина в сыворотке крови составляет 4,0-21,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю свободного билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% на долю связанного (2,0-5,0 мкмоль/л). К основным факторам, которые вызывают нарушение обмена жёлчных пигментов, принадлежат: повышенный гемолиз эритроцитов, нарушение синтеза билирубинглюкуронидов, нарушение выделения связанного билирубина из гепатоцитов в жёлчные капилляры (деструкция гепатоцитов), нарушение жёлчевыделения вследствие обтурации внепечёночных жёлчевыводящих путей. Паренхиматозная желтуха возникает при гепатитах, циррозах печени и характеризуется резким повышением содержания связанного билирубина в крови. В печени снижается образование билирубинглюкуронида, вследствие этого содержание свободного билирубина в крови также увеличивается. Гемолитическая желтуха возникает при усиленном гемолизе эритроцитов, что приводит к усилению образования свободного билирубина, так как печень не успевает его связывать. Увеличение концентрации связанного билирубина в случае обтурационной желтухи обусловлено перенаполнением жёлчных путей вследствие закупорки, разрыва и в дальнейшем переходе компонентов жёлчи в кровь; при этом в крови накапливается связанный билирубин (гипербилирубинемия), из мочи исчезает уробилиноген, однако вследствие билирубинурии она приобретает тёмную окраску, а из кала исчезает стеркобилин. В клинико-биохимических лабораториях проводят определение содержания билирубина и его фракций для дифференциальной диагностики желтух.