Р исунок 24.1

24.3.3. Третичная структура белка.

Вторичные спиральные структуры способны определенным способом скручиваться в пространстве в глобулы, часто близкие к сферическим, и эти скрученные структуры называются третичными. Причиной такого скручивания являются, кроме водородных, еще и ионные связи между группами СОО^ остатков дикарбоновых аминокислот и группами NH₃^ диаминокарбоновых кислот, ковалентными дисульфидными мостиками SS, а также гидрофобным взаимодействием между боковыми неполярными алкильными остатками жирных аминокислот.

24.3.4. Четвертичная структура белка.

Ряд белков, например гемоглобин, белки вирусов, ряд ферментов имеют четвертичную структуру. Они образуются из нескольких третичных структур, т.е. глобул, каждая из которых представляет одну макромолекулу белка с одной цепочкой. Эти глобулы биохимики называют протомерами (мономерами белка). Протомеры объединяются в олигомеры за счет в основном трех сил: гидрофобного взаимодействия, водородных связей и ионных взаимодействий групп СОО^ и NH₃^, принадлежащим разным протомерам.

В принципе для четвертичной структуры белка характерны два уровня организации: уровень субъединиц, по сути дела олигомеров, проявляющих функциональную активность (ферментативный катализ, способность связывать кислород и т.д.) и кооперативный уровень агрегатов (комплексов) субъединиц, которые объединяются в агрегаты за счет тех же трех сил: водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий. Образование агрегатов субъединиц (или их распад на субъединицы) играет в организме очень важные регуляторные функции. Обратимое образование агрегатов из субъединиц может регулироваться рН, концентрацией солей, самих субстратов, продуктов реакции и т.д. Например, комплексная молекула гемоглобина при уменьшении концентрации гемоглобина в растворе обратимо распадается на две субъединицы, каждая из которых состоит из двух протомеров,  и :

()() () + ().

Характерно, что ни протомер , ни протомер  кислород не присоединяют, тогда как субъединица () это уже делает, причем, присоединение первой молекулы кислорода к протомеру  ускоряет присоединение второй к протомеру , а это в свою очередь ускоряет присоединение еще двух молекул кислорода к агрегату в целом.

24.4. Установление первичной структуры белков.

24.4.1. Общая стратегия определения первичной структуры белка.

Общая стратегия определения первичной структуры белка сводится к следующим этапам:

1. Расщепление белковой молекулы на более простые фрагменты специфическими методами (химическими, щелочной или кислотный гидролиз, или энзиматическими). При этом олигомеры сначала расщепляют на протомеры, а уже затем их расщепляют на меньшие пептиды или вплоть до отдельных свободных аминокислот

2. Разделение и анализ малых пептидов и свободных аминокислот различными хорматографичскими и масс-хроматографическими методами.

3. Определение последовательности соединения аминокислот в пептидной цепочке, для чего необходимо идентифицировать N- и С-концевые остатки аминокислот. Чтобы достичь цели, необходимо получить небольшие фрагменты пептидов, аминокислотную последовательность которых можно точно установить, используя все ту же общую стратегию

Процедура сложная и трудоемкая, поэтому группа ученых устанавливала структуру гемоглобина 25 лет.

24.4.2. Введение метки в концевую аминогруппу.

В качестве метки часто используют 2,4-динитрофторбензол, который в слабо щелочной среде реагирует со свободной аминогруппой N-концевой аминокислоты:

Из полученной смеси хроматографически легко выделяется

N-(2,4-динитрофенил)аминокислота и идентифицируется методом масс-спектрометрии.

Применяют и другие метки, например, дансилхлорид (1-диметиаминонафталин-5-сульфонилхлорид):

24.4.3. Определение С-концевой аминокислоты.

С-Концевую аминокислоту легче всего можно определить реакцией с гидразином. Происходит гидразинолиз всех амидных связей в белке, но концевая свободная карбоксильная группа гидразинолизу не подвергается, поэтому все аминокислоты пептидной цепи образуются в виде гидразидов

Н₂NCHRCONHNH₂, тогда как С-концевая аминокислота Н₂NCHRCOОН остается свободной, легко выделяется и идентифицируется.

24.4.4. Последовательное мягкое расщепление белков методом Эдмана.

Этот метод состоит у взаимодействии -NH₂-концевой группы с фенилтиоизоцианатом (ФТИЦ) в щелочной среде с образованием фенилтиокарбамоилпептида:

Ф енилтиокарбамоилпептид

R-производное 3-фенил- остаток полипептида

2-тиогидантоина

При этом образовавшийся фенилтиокарбамоилпептид под действием горячей трифторуксусной кислоты перегруппировывается до производного тиогидантоина.

Уникальной особенностью разложения по Эдману является последовательное отщепление N-концевых аминокислот при сохранении цепочки полипептида, что остается. Повторением таких операций можно анализировать последовательность до 50 аминокислотных остатков в молекуле полипептида.