Занятие № 29
ТЕМА.ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА В ОРГАНИЗМЕ. ОРНИТИНОВЫЙ ЦИКЛ МОЧЕВИНООБРАЗОВАНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Цель занятия:1.Изучить пути образования и обезвреживания аммиака.
2.Освоить методы количественного определения мочевины и остаточного азота в сыворотке крови.
Исходный уровень знаний:
- химия аминокислот;
- реакции дез-, трансаминирования аминокислот;
- классификация и номенклатура ферментов;
- строение витаминов В2, РР, В6и содержащих их коферментов.
Содержание занятия.
I.2.Пути образования и обезвреживания аммиака в организме.
Способы обезвреживания аммиака.
Синтез мочевины: химизм, ферменты, нарушения.
II.1.Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕ-ВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (набор "Биотест")
Принцип метода.
Мочевина образует с диацетилмонооксимомв присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe3+в сильнокислой средекрасный комплекс, который фотометрируют.
Порядок выполнения работы.
Приготовить рабочий раствор, смешав одну долю раствора Реактива с одной долей раствора серной кислоты.
Осадить сывороточные белки: в центрифужную пробирку налить 1мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавить 0,1 мл сыворотки и центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин. Для анализа использовать супернатант.
Так же разбавить эталонный раствор: к 1мл 5% раствора ТХУ добавить 0,1 мл эталонного раствора мочевины.
|
Реактивы (мл) |
Проба |
Эталон |
Раствор сравнения |
|
Рабочий раствор |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
|
Супернатант |
0,1 |
- |
- |
|
Эталонный раствор |
- |
0,1 |
- |
|
Дистиллированная вода |
- |
- |
0,1 |
Пробирки закрыть крышкой из фольги и нагреть точно 10 мин на кипящей водяной бане, охладить (2-3мин) в струе холодной воды и не позже, чем через 15 мин измерить оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 1 см при 490-540 нм (светофильтр №5, зеленый).
РАСЧЕТ. Концентрацию мочевины (Х) рассчитывают по формуле:
А
Х= ― • 16,65 ммоль/л, где
В
А- оптическая плотность пробы,
В- оптическая плотность эталона.
Можно сделать перерасчет мочевины в азот мочевины умножением на коэффициент 0,466.
Нормальное содержание мочевины в сыворотке кровисоставляет2,50-8,32 ммоль/л; в моче - 333-583 ммоль/сут.
Верхняя граница содержания мочевины зависит от приема белков с пищей. При приеме белков более 2,5 г/кг веса в сутки содержание мочевины в сыворотке может быть до 10 ммоль/л.
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТА-ТОЧНОГО АЗОТА ПО МЕТОДУ АССЕЛЯ.
Наряду с белками в крови содержатся азотсодержащие вещества небелкового характера. После удаления белков крови осаждением безбелковый фильтрат содержит еще азот, носящий название "остаточного азота" и слагающийся из азота мочевины, мочевой кислоты, креатина, креатинина, индикана, аминокислот и других веществ.
Принцип метода.
Безбелковый фильтрат минерализуется в присутствии серной кислоты и пергидроля. При этом весь азот органических соединений превращается в сернокислый аммоний, которыйопределяется колориметрически с реактивом Несслера.
Порядок выполнения работы.
В пробирку отмерить 2,8 мл фосфорномолибденового реактива, добавить микропипеткой 0,2 мл крови, взболтать и оставить на 30 мин. Осадок белка отфильтровать. К 1 мл фильтрата прилить 0,05мл (2 кап) концентрированной серной кислоты. Во 2-ую пробирку поместить 2 кап концентрированной H2SO4и содержимое обеих пробирок сжечь на песочной бане (При нагревании жидкость в 1 пробирке буреет). Обе пробирки снять с огня, остудить, добавить по 2-3 кап. пергидроля и снова нагреть до полного обесцвечивания. После сжигания пробирки охладить и прибавить по 10 мл воды, 0,2 мл 50% раствора NaOH и 0,5 мл реактива Несслера. Испытуемая жидкость окрашивается в желтый цвет.
В контрольную пробирку прилить из микробюретки стандартный раствор сернокислого аммония по каплям до получения одинаковой окраски с опытным раствором. Количество раствора зафиксировать.
РАСЧЕТ. Количество остаточного азота вычисляют по формуле:
а • 0,05 • 100
Х =
мг%, где
0,067
а- кол-во мл стандартного раствора, пошедшего на титрование;
0,05- количество азота в 1 мл стандартного раствора в мг;
0,067- количество крови, взятой для сжигания (одна треть от 0,2 мл крови, взятой для осаждения белков).
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Каково нормальное содержание мочевины в крови? в моче?
В каких случаях содержание мочевины в крови повышается?
О чем свидетельствует снижение содержания мочевины в крови? Что такое "остаточный азот"?
Каково нормальное количество остаточного азота в крови?
Что такое азотемия и когда наблюдается?
Материал для самоподготовки. а)1 с.431-451; II, III