810

организмах имеется бесконечное разнообразие белковых молекул.

Единой классификации белков не существует. В зависимости от формы белковой молекулы различают фибриллярные и глобулярные белки, от выполняемой ими функции

– структурные, запасные, каталитические (ферменты), транспортные (переносчики), регуляторные (некоторые фитогормоны), защитные (антитела, токсины и т.д.). По составу белки различают простые или протеины (состоят только из аминокислот) и сложные или протеиды (в состав которых, наряду с аминокислотами входят другие вещества).

Простые белки, в зависимости от растворимости в различных растворителях, делят:

1.На альбумины – растворяются в воде;

2.На глобулины – растворимы в растворах нейтральных солей (4-10% растворы NaCl, KCl, (NH4)2SO4 и др.);

3.Проламины – растворимы в 60-80% этиловом спирте. Встречаются главным образом в семенах злаков;

4.Глютелины – растворимы в слабых растворах щелочей. Содержатся в семенах растений, составляя 1-3% их массы;

5.На протамины – белки с резко выраженными щелочными свойствами: в растениях не обнаружены. Содержатся

вмолоках рыб.

6.Гистоны – щелочные белки. Содержатся в ядрах кле-

ток.

Сложные белки (протеиды) подразделяются:

1.На глюкопротеиды – кроме аминокислот входят углеводы;

2.На липопротеиды – в составе их липиды;

3.Нуклеопротеиды – в составе их нуклеиновые кислоты;

4.Металлопротеиды – в составе их металлы;

231

5.На фосфопротеиды – белок связан с фосфорной кислотой эфирной связью;

6.Хромопротеиды – белок их связан с окрашенными соединениями небелковой природы (хлорофилл, гемоглобин).

Запасные белки откладываются в семенах в виде особых (алейроновых) зерен и представляют главным образом глобулины, которые составляют большую часть белков семян бобовых и масличных культур. Так, в семенах гороха содержится легумин, вицеллин, в семенах фасоли – фазеолин, в семенах сои – глицинин, в семенах конопли – эдестин.

Для семян злаковых культур характерны белки проламины. Так, в семенах пшеницы имеется глиадин, входящий в состав клейковины, в семенах ячменя – гордеин, кукурузы – зеин, овса – авенин. Кроме глиадина в состав клейковины пшеницы также входит белок группы глютелинов – глютенин.

Белки в семенах растений могут быть обнаружены при помощи цветных реакций, таких как биуретовая, ксантопротеиновая, миллоновая и реакция на серу.

Цель работы. Провести обнаружение белков в муке различных зерновых и зернобобовых культур путем биуретовой и ксантопротеиновой реакций и реакции на серу, а также реакций на получение обратимых и необратимых осадков.

Материалы и оборудование: мука различных зерновых

изернобобовых культур; чашки фарфоровые; пробирки; штативы для пробирок; мерные цилиндры на 25 или 50 мл; спиртовки; фильтры бумажные; воронки; пробиркодержате-

ли; 30% NaOH; 20% CuSO4; реактив Миллона (раствор азотнокислой ртути в HNO3).

Ход работы. Для обнаружения запасных белков в семенах пшеницы (или других зерновых культур), навешивают 25 г муки, высыпают еѐ в фарфоровую чашку, приливают немного воды (10-12 мл) и замешивают густое тесто, которое

232

оставляют полежать 15-20 минут. После этого тесто осторожно отмывают водой из-под крана от крахмала и отрубей. В оставшейся после промывания массе, клейковине, находятся белки. Клейковину помещают в чашку с водой и используют для проведения цветных реакций для обнаружения белков.

Для обнаружения белков в гороховой или фасолевой муке навешивают 5 г муки, переносят еѐ в колбу или чашку, приливают 20-30 мл 10% раствора поваренной соли, размешивают и оставляют настаиваться 25-30 минут, затем раствор фильтруют через бумажный фильтр, берут по 2-3 мл фильтрата, переносят в пробирки и проводят цветные реакции для обнаружения белков.

Наличие белков в клейковине и вытяжке из гороховой (или фасолевой) муки устанавливают проведением следующих реакций.

Биуретовая реакция. От клейковины отрывают небольшой комочек величиной с горошину и помещают его в пробирку. К комочку клейковины или к фильтрату из муки гороха (фасоли) приливают 1мл 30% щелочи и 2-3 мл 20% раствора медного купороса. При наличии белка раствор приобретает фиолетовую окраску, а комочек клейковины покрывается фиолетовым налетом. Следует избегать избытка медного купороса, так как иначе фиолетовая окраска маскируется синей.

Биуретовая реакция связана с присутствием в молекуле белка – СО – NH – группировки. Свое название она получила от биурета – продукта нагревания мочевины, при котором выделяется аммиак и остается твердое вещество биурет.

233

Ксантопротеиновая реакция. К исследуемому матери-

алу приливают несколько капель крепкой азотной кислоты и подогревают до кипения. Комочек клейковины или солевой раствор окрашивается в желтый цвет, который указывает на наличие белка в исследуемом материале. Если после охлаждения в пробирку прибавить избыток аммиака, то желтая окраска переходит в ярко-оранжевую. Изменение окраски происходит со всеми белками, содержащими аминокислоты фенилаланин, тирозин или триптофан.

Миллоновая реакция. Для обнаружения белка, содержащего аминокислоту тирозин, берут 1-2 мл фильтрата с белком или комочек клейковины, приливают несколько капель реактива Миллона и кипятят. При наличии белка комочек клейковины приобретает мясо-красную окраску, а фильтрат белка дает покраснение.

Реакция на серу. Серу содержат аминокислоты цистин, цистеин и метионин. Присутствие в белке этих аминокислот определяют прибавлением к клейковине или раствору белка равного объема едкой 40% щелочи и 2-3 кристаллика уксуснокислого свинца или нескольких капель крепкого его раствора. При осторожном нагревании происходит отщепление сероводорода от серосодержащих аминокислот, который со свинцом дает почернение клейковины или черный осадок раствора. Большинство белков дает эту реакцию.

Осаждение белков. При количественном определении белков водных и солевых растворов пользуются их способностью осаждаться при нагревании и действии кислот. Осадки могут быть необратимые (свертывание) и обратимые (высаливание).

Необратимые осадки выпадают при кипячении или добавлении крепких кислот – азотной, серной, соляной, а

234

также солей тяжелых металлов (свинца, меди, ртути). Проделайте реакции:

a.Налейте в пробирку 2-3 мл прозрачной солевой вытяжки из гороховой (фасолевой) муки и нагрейте до кипения. Раствор помутнеет из-за денатурации белка, который выпадает в необратимый осадок.

b.Возьмите вторую пробирку с таким же количеством солевой вытяжки и добавляйте в неѐ по каплям концентрированную кислоту (соляную, серную или азотную). Когда концентрация раствора достигнет 50%, содержимое пробирки помутнеет, белок выпадет в осадок без нагревания.

Обратимые осадки белка (высаливание) можно получить так:

a.К 1-2 мл солевой вытяжки приливают избыток воды. Вытяжка разбавляется и белок (глобулин) выпадает в осадок, так как в воде и слабых солевых растворах он не растворяется.

b.Добавьте к помутневшему слабому раствору в пробирке с выпавшим осадком глобулина немного раствора поваренной соли (или сульфата аммония) и вы увидите исчезновение мути, что указывает на обратимый характер осадка.

На основе наблюдений сделайте заключение о наличии белков в семенах исследуемых культур.

Вопросы для самоконтроля

1.Чем отличаются запасные белки от конституционных?

2.Как классифицируются протеины?

3.Как классифицируются протеиды?

4.В семенах каких растений преобладают глобулины, проламины, глютелины?

5.На чем основано обнаружение запасных белков в растениях?

6.Чем отличаются обратимые осадки от необратимых?

235

Ферменты

Ферменты – это специфические белковые молекулы, синтезируемые живыми клетками. С их помощью осуществляются многочисленные химические реакции с большой скоростью. Следовательно, ферменты являются биологическими катализаторами, ускоряющими течение реакций. Они снижают силы химического сопротивления, т.е. энергию активации или энергетический барьер.

По химической природе ферменты – простые или сложные белки. Небелковый компонент, прочно связанный с белком, называют простетической группой, а слабо связанный, обслуживающий несколько ферментов, – коферментами. Во многих случаях в качестве простетических групп или коферментов могут быть витамины или их производные, например, витаминов группы В (В1, В2, В6), никотиновой кислоты и других, а также металлы (железо, медь, цинк), ФАД, НАД, НАДФ и другие.

Ферменты обладают специфичностью, т.е. один фермент катализирует обычно только одну реакцию. По типу катализируемых ими химических превращений ферменты разделены на 6 классов:

1)оксидоредуктазы – катализируют окислительновосстановительные реакции (дегидрогеназа, оксидаза и др.);

2)трансферазы – катализируют перенос целых атомных группировок от одного соединения к другому (трансаминаза, киназа и др.);

3)гидролазы – осуществляют распад различных органических соединений с участием воды (гидролиз: липаза, амилаза, пептидаза и др.);

4)лиазы – катализируют присоединение какой-либо группировки к органическим соединениям или отщепление от субстратов какой-либо группировки без участия воды (декарбоксилаза, альдолаза и др.);

236

5)изомеразы – катализируют реакции изомеризации (изомераза, мутаза);

6)лигазы (синтетазы) – катализируют синтез органических соединений с использованием энергии АТФ (синтетаза).

Ферментативные реакции, протекающие в клетке, идут согласованно, подчиняясь строгой регуляции. Таким образом, ферменты служат для регулирования происходящих в клетке реакций и обеспечивают надлежащую их скорость.

Работа 82. Получение шкалы гидролиза крахмала амилазой при разных температурах

Вводные пояснения. Гидролиз крахмала можно провести не только кислотой. В растениях его расщепление осуществляется с помощью ферментов амилаз, относящихся к классу гидролаз, через те же промежуточные продукты (декстрины), которые образуются при кислотном гидролизе (см. работу 80), в чем легко убедится по реакции с раствором йода.

Амилазы широко распространены в растительном мире: в зеленых листьях, семенах и других органах растений. Особенно активны амилазы в солоде – размолотых проросших зернах злаков.

В зависимости от характера действия на крахмал различают α-амилазу (расщепляет внутренние связи в молекуле), β-амилазу (последовательно отщепляет остатки мальтозы от концов молекулы крахмала) и глюкоамилазу (расщепляет крахмал с образованием свободной глюкозы).

Если налить в пробирки одинаковое количество раствора амилазы и крахмального клейстера, выдержать их при разных температурах и периодически делать пробы йодом, то по скорости появления промежуточных продуктов можно судить об активности фермента.

237

Цель работы. Провести гидролиз крахмала амилазой при разных температурах и продолжительности гидролиза, а также пронаблюдать за активностью этого фермента.

Материалы и оборудование: солод; глицерин; 1%

крахмальный клейстер; слабый раствор йода (20мл концентрированного раствора йода на 1л воды); мерные цилиндры на 5-10 мл; пробирки; термометры; электроплитка; водяная баня; штативы; пипетки на 1, 2 и 5 мл.

Ход работы. Готовят солодовую вытяжку, содержащую амилазу. Для этого используют наклюнувшиеся семена ржи или ячменя (5-10 г), растирают их в ступке с песком, добавляют небольшое количество теплой воды (35-400С) и глицерина для ускорения извлечения фермента, перемешивают, дают отстояться в течение не менее 30 мин. и профильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Фильтрат содержит активную амилазу.

В 14 пробирок, расставленных в штативе в два ряда, наливают по 5 мл слабого раствора йода в йодистом калии. В две другие пробирки наливают по 10 мл крахмального клейстера и добавляют по 1 мл амилазы, полученной из солода. Содержимое этих двух пробирок хорошо перемешивают, затем одну из них ставят в водяную баню с температурой +450С, а другую – в штатив при комнатной температуре.

С момента начала опыта, как только внесли амилазу и перемешали еѐ с крахмальным клейстером, через каждые 2 минуты берут из этих пробирок по 0,5 мл гидролизата и переносят в пробирки с йодом: из пробирки с температурой +450С – в один ряд, из пробирки с комнатной температурой

– в другой ряд. Важно, чтобы из обеих пробирок пробы брались одновременно. В зависимости от активности фермента интервал между взятием проб может быть изменен.

238

Йод будет окрашивать крахмал и продукты гидролиза в разные цвета. После завершения гидролиза цвет гидролизата от присутствия йода изменяться не будет.

С гидролизатом, оставшимся в пробирках, проделывают реакцию на редуцирующие сахара. Для этого наливают в чистые пробирки по 1-2 мл гидролизата, добавляют в них равное количество жидкости Фелинга, кипятят. При наличии редуцирующих сахаров выпадает осадок закиси меди. По количеству выпавшего осадка закиси меди можно судить об активности амилазы в зависимости от температуры.

Результаты зависимости гидролиза от температуры и его продолжительности заносят в таблицу, указав окраску гидролизата в соответствующей графе.

Делают вывод о влиянии температуры и продолжительности гидролиза на активность амилазы.

Вопросы для самоконтроля

1.Что такое амилаза и каково еѐ значение для живого организма?

2.В каких органах растений в основном локализована амилаза?

3.Что такое солод?

4.Как объяснить сладость солода?

5.Как извлечь амилазу из растений?

6.Чем отличаются ферменты от неорганических катализаторов?

Работа 83. Инактивация амилазы кипячением

Вводные пояснения. Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Как белковые вещества все ферменты чрезвычайно неустойчивы и легко инактивируются под влиянием различных внешних факторов. Активность ферментов, прежде всего, зависит от температуры и рН среды. Большинство ферментов наибольшую активность проявляют при 40-500С. Дальнейшее повышение температуры вызывает денатурацию белка и потерю каталитической ак-

239

тивности фермента, т.е. его инактивацию, которая бывает обратимой и необратимой. Кипячение вызывает необратимое инактивирование ферментов.

Цель работы. Убедиться, что активность ферментов зависит от температуры и реакции среды на примере амилазы. Кипячение вызывает инактивирование ферментов.

Материалы и оборудование: водная вытяжка амилазы; 1% крахмальный клейстер; раствор йода в йодистом калии в капельнице (концентрированный раствор разбавляют в три раза); пробирки; пипетки на 2 и 5 мл; пробиркодержатели; спички, спиртовки.

Ход работы. В две пронумерованные пробирки наливают по 2 мл солодовой вытяжки. Содержимое одной пробирки кипятят, тщательно прогревая еѐ стенки. Затем в обе пробирки добавляют по 5 мл крахмального клейстера, перемешивают и ставят на водяную баню с температурой 400. Через 10 мин вносят в обе пробирки по нескольку капель раствора йода до появления окрашивания.

Отмечают результаты и делают выводы о причинах разного окрашивания содержимого пробирок.

Вопросы для самоконтроля

1.Как действует высокая температура на ферменты?

2.Что такое обратимое и необратимое инактивирование ферментов?

3.Какую роль в жизни растений играет амилаза?

4.К какому классу ферментов относится амилаза?

Работа 84. Обнаружение амилазы в прорастающих семенах

Вводные пояснения. Активность амилаз особенно велика в процессе прорастания семян. Синтезируясь в клетках семени после его набухания, ферменты действуют не только в тех клетках, в которых они образовывались, но и вне клеток, диффундируя в другие клетки и во внешнюю среду (экзоферменты).

Чтобы наблюдать выделение амилазы из клеток семян хлебных злаков, нужно разрезать зерновки, так как семенная

240