810

Ход работы. Спиртовую вытяжку пигментов или раствор хлорофилла в бензине, полученный при разделении пигментов по Краусу, помещают на темную бумагу у источника освещения и рассматривают в отраженном свете. Вытяжка хлорофилла будет темно-красного цвета. Если рассмотреть ее в проходящем свете, то она будет иметь изумрудно зеленый цвет (рис. 13).

Рис. 13. Рассмотрение спиртовой вытяжки хлорофилла:

А – в отраженных лучах; Б – в проходящих лучах; а – источник света; б – пробирка с вытяжкой; в – глаз; г – падающие лучи; д, е, отраженные лучи; ж – лучи, прошедшие через хлорофилл.

После рассмотрения вытяжки хлорофилла следует отметить окраску раствора и записать выводы о способности хлорофилла к флюоресценции.

Вопросы для самоконтроля

1.Что такое флуоресценция хлорофилла?

2.Почему флуоресценция хлорофилла в спиртовой вытяжке сильнее, чем в листе?

3.Работники какой профессии часто встречаются с явлением флуоресценции, не задумываясь об этом?

101

Работа 39. Количественное определение пигментов

Вводные пояснения. Хлорофилл и каротиноиды – важнейшие компоненты фото-синтетического аппарата растений. Количественное их содержание в листьях зависит от жизнедеятельности организма, его генетической природы. Поэтому оно может быть использовано как физиологический показатель, характеризующий онтогенетические, возрастные и генетические особенности растений. Количество пигментов отражает и реакцию растительного организма на условия произрастания. Поэтому при физиологических исследованиях часто возникает необходимость проследить за динамикой содержания хлорофилла и каротиноидов в отдельных органах.

Пигменты лучше всего экстрагировать из свежего растительного материала, но можно и из фиксированного. В последнем случае надежным способом фиксации служит замораживание тканей с последующей лиофилизацией (вакуумная или лиофильная сушка).

Лиофилизация – лиофильная сушка, сублимационная сушка, метод высушивания биологических объектов и пищевых продуктов в замороженном состоянии под вакуумом. При этом вода удаляется из замороженного материала путем испарения льда, минуя жидкую фазу.

Недопустимо фиксирование растительного материала сухим жаром в сушильном шкафу, поскольку постепенное повышение температуры сопровождается усилением гидролитических процессов, в том числе гидролиза хлорофилла. Фиксированные листья помещают в эксикатор и хранят в темном и прохладном месте. При работе с сухим материалом берут 80%-ный раствор ацетона или 90%-ный этиловый спирт.

Вытяжку используют для количественного анализа. Концентрацию пигментов определяют при помощи фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. При этом надо

102

различать учет пигментов в экстракте до и после разделения на отдельные компоненты. Например, в спиртовой или ацетоновой вытяжке, содержащей все пигменты, можно определить концентрацию хлорофиллов фотоэлектроколориметром, не отделяя их от каротиноидов. Это возможно, потому что для хлорофиллов, в отличие от каротиноидов, характерно поглощение и в красной части спектра.

Количество каротиноидов в смеси с хлорофиллами можно определить только на спектрофотометре. Для более тонкого количественного анализа пигментной системы листьев предварительно проводят разделение хроматографическим методом. Содержание пигментов выражают в миллиграммах на единицу сырой или сухой массы (на 1г), в процентах сырой (сухой) массы и на единицу площади листьев (дм2).

Цель работы. Провести количественное определение пигментов зеленого листа с помощью колориметра.

Материалы и оборудование: листья растений; 96%-ный раствор этанола; кварцевый песок; СаСО3; вазелин; весы; ножницы; ступки с пестиками; мерные колбы на 50 мл; воронки; бумажные фильтры; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр ФЭК-56М.

Ход работы. Для получения спиртовой вытяжки навеску (0,1–0,5г) листьев определенного яруса помещают в фарфоровую ступку, добавляют немного диоксида кальция, промытого кварцевого песка и растирают с 2-3 мл 96%-ного раствора этанола. К растертой массе добавляют 4-5 мл этанола и снова растирают несколько минут. После отстаивания раствора нижнюю сторону носика ступки слегка смазывают вазелином, экстракт осторожно сливают по палочке в воронку на фильтр.

Экстракцию небольшими порциями чистого растворителя повторяют до тех пор, пока пигменты не будут извлечены полностью. Фильтр также промывают небольшими

103

порциями растворителя до тех пор, пока все пигменты не перейдут в фильтрат. Далее содержимое колбочки доводят растворителем до метки, закрывают каучуковой пробкой, тщательно взбалтывают и используют для определения концентрации пигментов.

Рис. 14. Общий вид фотоэлектроколориметра ФЭК-56М:

1 – корпус прибора; 2

– крышка; 3 – рукоятка шторки; 4 – кюветодержатели; 5 – окна отсчетных барабанов со шкалой; 6 – отсчетные барабаны; 7 – гальванометр; 8 – барабан переключателя светофильтров; 9 – рукоятка установки стрелки гальванометра на «О»; 10рукоятка чувствительности; 11 – барабан правого кюветодержателя.

Анализ пигментов выполняют при комнатной температуре на рассеянном свету, так как при сильном освещении может произойти фотоокисление хлорофилла. Хранят вытяжку в темном холодном месте.

Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фотоэлементами в результате неодинаковой интенсивности световых потоков, прошедших через растворитель и раствор. Общий вид фотоэлектроколориметра ФЭК-56М представлен на рис. 14.

104

Прибор снабжен набором кювет с различными расстояниями между рабочими гранями. Это позволяет выбрать для раствора кювету такой рабочей длины, которая позволяла бы выполнять измерение на участке шкалы, дающем наиболее надежные результаты. Так, для хлорофилла этот интервал расположен между делениями 0,1 и 0,6 красной шкалы левого барабана.

Включают прибор в сеть и тумблер стабилизатора ставят в положение «Включ.». Прибору дают прогреться 30 мин. Затем при закрытой шторке вращением отсчетных барабанов 6 совмещают риску с «0» делением шкалы, после чего при помощи рукоятки 9 устанавливают стрелку гальванометра на «0». Далее открывают крышку прибора, и в левый кюветодержатель ставят кювету с растворителем (10 мм), а в правый – соответственно, кюветы с растворителем и исследуемым раствором. В кюветодержателях 4 все кюветы должны быть установлены на одинаковом расстоянии от входного отверстия и обращены к источнику света одной и той же гранью. Рабочие грани кювет следует протереть фильтровальной бумагой. Чтобы не загрязнить их, нельзя касаться этих граней ниже уровня жидкости.

Вращением барабана 8 установите красный светофильтр. В правом кюветодержателе в световой поток поместите кювету с раствором. Установите «0» на правом барабане. Вращением левого барабана установите стрелку гальванометра на «0». Затем поворотом барабана 11 в правом световом пучке замените кювету с раствором на кювету с растворителем. Вращением правого отсчетного барабана 11 возвратите стрелку гальванометра в нулевое положение. Отсчет берут по красной шкале правого барабана.

Колориметрирование проводят 2-3 раза. Если оптическая плотность больше 0,6, то вытяжку следует разбавить в два раза. Если же показания ФЭКа окажутся ниже 0,08, то

105

необходимо выполнить всю работу заново, увеличив навеску листьев.

Показания шкалы барабана переводят в величины концентрации, используя калибровочный график. Для этого готовят серию стандартных растворов хлорофилла возрастающей концентрации и находят оптическую плотность каждого из них. Затем строят график (рис.15).

Содержание хлорофилла, мг/50 мл

Рис. 15. Калибровочный график для определения хлорофилла.

На оси абсцисс откладывают значения концентрации, а на оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности. Точки пересечения соединяют и получают калибровочный график.

Стандартные растворы готовят в мерных колбочках на 25 мл. В качестве стандартного можно использовать также раствор Гетри, который по своей окраске соответствует 85 мг хлорофилла в 1 л раствора.

Раствор Гетри готовят следующий образом: 1 г сер-

нокислой меди CuSO4 х 5Н2O растворяют в мерной колбочке и доводят дистиллированной водой до 100 мл; 2 г двухромовокислого калия К2Сr2О7 растворяют в другой мерной колбе на 100 мл. В мерную колбу на 100 мл переносят 28,5 мл приготовленного раствора сернокислой меди, 50 мл раство-

106

ра двухромовокислого калия и 10 мл двунормального раствора аммиака доливают до 100 мл дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой. При определении оптической плотности стандартных растворов кюветы должны быть той же рабочей длины, что и при определении оптической плотности исследуемого раствора.

Для того чтобы вычислить концентрацию хлорофилла, на оси ординат находят установленную величину оптической плотности и от нее проводят горизонтальную прямую до пересечения с кривой графика. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на абсциссу и определяют концентрацию хлорофилла в % от массы сырых листьев по формуле:

Х 100 В , г де

А

В – количество хлорофилла в вытяжке, мг; А – масса сырых листьев, взятых для анализа, мг;

100 – коэффициент для выражения в процентах. Результаты определения записывают в таблицу по при-

веденной ниже форме и делают выводы.

Определение концентрации хлорофилла

Вопросы для самоконтроля

1.От чего зависит количественное содержание пигментов в листьях растений?

2.Какой растительный материал лучше использовать для определения содержания пигментов?

3.Какие методы фиксации растительного материала можно применять? Их суть?

4.Почему нельзя фиксировать растительный материал сухим жаром?

107

5.Какие приборы используются для определения концентрации пигментов?

6.Как приготовить растворы для построения графика?

7.В каких единицах измеряют содержание пигментов?

Работа 40. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии

Вводные пояснения. Впервые метод хроматографии применил М.С. Цвет в 1906 году. Он разделил пигменты листа и выделил хлорофиллы a и b. Метод основан на распределении пигментов между целлюлозой хроматографической бумаги и подвижной фазой растворителей. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движутся растворители, то молекулы пигментов, нанесенные на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения. Чем выше растворимость пигмента в подвижной фазе, тем дальше он продвигается по бумаге вместе с растворителем, и наоборот. Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения.

Хроматографирование на бумаге выполняют восходящим и нисходящим способами. При восходящей хроматографии бумажную полосу подвешивают вертикально; при этом нижний ее конец, на который нанесена смесь пигментов, погружают в растворитель. По мере движения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение растворенных веществ.

При нисходящей хроматографии верхний конец бу-

мажной полосы со смесью пигментов, нанесенных недалеко от кромки бумаги, закрепляют в лотке, который размещают

108

в верхней части камеры. Нижний конец бумаги располагают так, чтобы он не касался налитого на дно камеры растворителя. В результате действия капиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает передвигаться вниз по бумажной полосе, в результате чего смесь разделяется. Нисходящую хроматографию, как более простую, применяют чаще.

Хроматографирование выполняют в герметично закрытых сосудах, где поддерживают насыщенную парами растворителей атмосферу, что предотвращает их испарение с бумаги. Для эффективного разделения пигментов бумага должна быть равномерной толщины и достаточно плотной.

В зависимости от цели исследования применяют одномерные и двухмерные хроматограммы. В первом случае определяют либо хлорофиллы, либо каротиноиды. Если необходимо полное разделение смеси пигментов на отдельные компоненты, применяют двухмерную хроматограмму. В этом случае последовательно разгоняют пигменты на бумаге сначала в одном направлении, а затем в направлении, перпендикулярном первому.

Двухмерная хроматография, применяющаяся для массовых количественных определений, сложна и трудоемка. Поэтому в практикуме используют разделение основных пигментов зеленого листа на одномерной хроматограмме.

Цель работы. Провести разделение пигментов зеленого листа методом восходящей и нисходящей бумажной хроматографии.

Материалы и оборудование: листья растений; ацетон;

бензин; бензол; хлороформ; изопропиловый и этиловый спирты; вазелин; СаСО3; кварцевый песок; ножницы; ступки с пестиками; пробирки на 25 мл или колбы; фильтры; воронки; цилиндры с крышкой или корковой пробкой, обернутые темной бумагой (25x7 см); хроматографическая бумага размером 25x5 см; вентиляторы или фен; нитки; линейки.

Ход работы. Для анализа отбирают листья определенного яруса, вырезают центральную жилку, а из оставшихся

109

частей берут навеску 0,5 г. Величина навески может меняться в зависимости от содержания пигментов.

Отвешенную пробу быстро измельчают ножницами, переносят в фарфоровую ступку и тщательно растирают с чистым кварцевым песком, предварительно внеся в ступку на кончике ножа СаСО3 для нейтрализации кислот клеточного сока. Затем приливают 3-4 мл этанола и продолжают растирать. Смазав снизу носик ступки вазелином, экстракт сливают по палочке в воронку с фильтром.

К оставшейся в ступке массе приливают 3-4 мл спирта и вновь растирают. Затем жидкость сливают в воронку. Экстрагирование пигментов из растительного материала повторяют до тех пор, пока сливная жидкость не станет бесцветной. Далее материал переносят на фильтр, ступку ополаскивают небольшим количеством растворителя и сливают эту жидкость в воронку. После этого объем экстракта доводят спиртом до метки 25 мл.

Разделение пигментов (рис. 16). Берут лист хромато-

гра-фической бумаги размером 25x5см и на одном его конце, отступив от края 2,5см, при помощи линейки проводят простым карандашом тонкую линию. Полоску хроматографической бумаги опускают концом в вытяжку на несколько секунд. Когда вытяжка поднимется по бумаге на 1,5см, полоску бумаги высушивают в токе теплого воздуха, снова погружают в раствор пигментов самым краешком и держат так до тех пор, пока раствор не поднимется до первоначального уровня.

Рис. 16. Разделение пигментов:

а – нанесение вытяжки на хроматографическую бумагу; 1 – хроматографическая бумага; 2 – место нанесения смеси пигментов; 3 – чашка с вытяжкой пигментов; б — общий вид сосуда для восходящей хроматографии: 1 – пробка; 2 – нитка; 3 – стеклянный сосуд; 4 – хроматографическая бумага; 5 – смесь растворителей.

110