730

втечение 15 мин. Остудить до 45 С и асептически добавить стерильную дефибринированную кровь кролика или человека. Тщательно перемешать и разлить по 5 мл в пробирки или по 25 мл во флаконы. Оставить среду в прохладном месте в наклонном положении для формирования скоса.

Часть В:

Размешать 11,2 г порошка части Вв1000 мл дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121 С) в течение 15 мин. Остудить и асептически добавить по 2 мл в пробирки ли по 15 мл во флаконы поверх застывшей среды из части А.

Принцип и оценка результата:

Внешний вид порошка:

Часть А:Гомогенный сыпучий желтый порошок. Часть В:Гомогенный сыпучий белый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5% агаровому гелю (часть А).

Цвет и прозрачность готовой среды:

Готовая среда из части А перед добавлением крови имеет светло-янтарную окраску, слегка опалесцирует, а после добавления крови становится красной: часть В – прозрачная бесцветная жидкость.

Кислотность среды:

При 25 С водный раствор части А (3,1% вес/об) имеет рН 7,3 ± 0,2, а водный раствор части В (1,12% вес/об) имеет рН 7,0 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 2448 ч при 35-37 С.

51

После проверки на стерильность в термостате при 37 С в течение 24 ч проросшие пробирки удаляют, а стерильные, если они не засеваются сразу, сохраняют до посева в холодильнике.

Материалом для посева может служить кровь, стерильно полученная путем укола, жидкость из нераспавшихся кожных лейшманиозных бугорков или инфильтрата вокруг язвы, пунктат костного мозга грудины, селезенки, лимфатических узлов, содержимое кишечника москитов и т. п.

Кровь из вены берут в количестве 8–10 мл, разводят в 5–6 раз физиологическим раствором с цитратом натрия (1 мл 3,8% цитрата на 10 мл крови), центрифугируют 5 мин при 750–1000 об/мин. Затем отсасывают пипеткой жидкую часть и поверхностный белесоватый слой осадка, в котором содержатся лейкоциты и паразиты, центрифугируют еще 10 мин при 1500–2000 об/мин. Для посева используют нижний слой надосадочной жидкости и осадок.

Пунктаты и содержимое желудков москитов перед посевом разводят в 1–2 мл физиологического раствора. Посевы производят на возможно большее число пробирок со средой (6-8), внося материал в конденсационную воду.

Наиболее подходящая температура для роста лейшманий +22–25 С. B культурах вырастают только лептомонадные (жгутиковые) формы лейшманий, которые можно обнаружить на 2-3-й день, а при скудном содержании в посевном материале и значительно позднее – на 7–10-й день после посева.

Лейшмании растут не только в конденсационной воде, но и на поверхности агара в виде каплеобразных колоний. При длительном культивировании пересевы производят через каждые две недели. Ha всех этапах культивирования необходимо строгое соблюдение стерильности, так как

52

лейшмании в присутствии бактерий на питательных средах быстро погибают.

Разными авторами предложен ряд других сред для культивирования лейшманий. Многие из них являются модификациями среды NNN-arap.

Среда Роджерса

Заслуживает внимания как наиболее простая по составу. Физиологический раствор с добавлением 8% лимоннокислого натрия разливают в маленькие пробирки по 1 мл, стерилизуют в автоклаве. B засеваемые пробирки вносят кровь исследуемого больного по 0,5–1 мл. Лептомонадные формы лейшманий появляются в заметных количествах на 3–4-й день инкубации при +22–25 С.

Реакция иммунофлуоресценции

Для диагностики лейшманиоза у животных и человека за рубежом в настоящее время широко применяют реакцию иммунофлуоресценции (РИФ).

Для приготовления антигена используют культуру лейшманий в экспоненциальной фазе роста, которую сначала центрифугируют при температуре 25 С 10 минут на скорости 7 000 оборотов/мин, затем отмывают при комнатной температуре буферным раствором с рН 7,2 с добавлением 10% фетального бычьего сывороточного альбумина центрифугированием три раза по 10 минут. Осадок аккуратно гомогенизируют, переносят в равный раствор 1%- ногопараформальдегида и оставляют на ночь, после чего снова отмывают буферным раствором.

53

Рис. 14. Лейшмания. Флюоресцирующая микроскопия. Увел.Х400. (фото автора)

Иммуно-хроматографический анализ

ImmunoRunAntibodyDetectionKit

CANINELEISHMANIA

Тест ImmunoRun CLI предназначен для обнаружения антител (Ab) Leishmaniainfantum (CLI) у собаки в крови/сыворотке/плазме крови. Набор содержит все компоненты, необходимые для выполнения простого и точного теста менее чем за 10 минут.

Тест ImmunoRun CLI выявления антител содержит 5 отдельных устройств, предназначенных для выполнения иммуно-хроматографического анализа для качественного определения CLI -Ab из образцов. Каждое устройство содержит 2 основных окна: круглое окно, куда вносится образец, и прямоугольное окно для оценки результатов, отмеченное 2 буквами: «С» – зона контроля и «T» – зона теста. Обе линии невидимы, до того, как наступит реакция. Контроль в виде фиолетовой линии должен появиться с каждой текущей реакцией, так как она используется для

54

проверки теста. Специально подобранный антиген CLI, используется в качестве захвата и в качестве реактива обнаружения. Антитела антиCLI в образце связываются с коллоидным золотом конъюгированным с антигеном FIV и формируют комплекс, который мигрирует к зоне теста, и его накопление создает полосу. Это позволяет CLI Ab устройству идентифицировать CLI антитела в собачьей крови / плазмы / сыворотки с высокой степенью точности.

Процедура анализа

Возьмите кровь у собаки. Если используете антикоагулянт, то образец крови должен быть проверен в течение 24 часов. Если тест откладывается, образец центрифугировать для отделения плазмы / сыворотки от других компонентов крови и хранить в холодильнике (2–7 C) в течение 72 часов, или замораживая (ниже -20 C) в течение более длительного периода.

При хранении в холодильнике заранее достаньте тест, чтобы он согрелся до комнатной температуры. Извлеките из упаковки тест-кассету. Поместите кассету горизонтально на ровной сухой поверхности. Пипеткой нанесите 1 каплю крови / сыворотки / плазмы образца (~ 10 мкл) в лунку на тест-кассете. Добавьте в лунку 2 капли (около 80 мкл) аналитического разбавителя из флакона. Если через 1 минуту в окне результатов не появится фоновое окрашивание, добавьте еще одну – третью – каплю аналитического разбавителя.

Следите за контрольной линией («C»), как она отображается в окне результатов. В случае положительного результата, в зоне теста («T») так же должна появиться линия.

Результаты должны быть прочитаны в течение 5–20 минут после исследования.

55

Иммуноферментный анализ Набор LeishmaniainfantumIgG ELISA

Набор LeishmaniainfantumIgG ELISA предназначен для качественного определения антител класса IgG к лейшманиям (Leishmaniainfantum) в сыворотке или плазме человека, методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Принцип работы набора

Качественное иммуноферментное определение антител к лейшманиям (Leishmaniainfantum) основано на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). На лунки микротитрационных стрипов уже нанесены антигены Leishmaniainfantum для связывания соответствующих антител из образца. После промывания лунок для удаления несвязанного материала образца добавляют конъюгат белка A, меченного пероксидазой хрена (HRP). Этот конъюгат связывается с удержанными специфическими антителами к Leishmaniainfantum. Иммунный комплекс, образованный связанным конъюгатом, визуализируется посредством добавления тетраметилбензидинового субстрата (ТМБ), который в результате реакции дает продукт синего цвета. Интенсивность цвета данного продукта пропорциональна количеству специфических антител класса IgG к Leishmaniainfantum в образце. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты. Это приводит к появлению желтого цвета в конечной точке. С помощью ридера для микролуночных планшетов для ИФА определяют оптическую плотность на длине волны 450 нм.

56

Аналитические характеристики набора

Специфичность диагностического метода составляет > 85%. Чувствительность диагностического метода составляет

91%.

CanineLeishmania ELISA

Набор CanineLeishmania ELISA предназначен для определения уровня Leishmania в собачьей сыворотке, плазме, культуральной среде или любой биологической жидкости.

В этом наборе ELISA в качестве метода используется сэндвич-ELISA. Стрип-планшет Microelisa, входящий в этот набор, предварительно покрыт антителом, специфичным к Leishmania. Присутствие Leishmania определяется путем сравнения с референснымзначением.

флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые

57

гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала.

Специфичность тестирования подтверждалась методом секвенирования детектируемых участков генома. При проведении тестирования данной панели, а также образцов ДНК человека неспецифических реакций выявлено не было.

Проведение ПЦР-исследования

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов: - Экстракция ДНК из исследуемых образцов. - Амплификация. - Флуоресцентная детекция продуктов амплификации по «конечной точке». - Интерпретация результатов.

Интерпретация результатов.

Полученные результаты интерпретируют на основании данных об уровне флуоресцентного сигнала относительно фона по соответствующим каналам для контрольных образцов и проб ДНК, выделенных из клинических образцов. Интерпретация производится автоматически с помощью программного обеспечения используемого прибора. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК.

Биопроба

Возбудитель кожного лейшманиоза может быть экспериментально привит белым мышам, песчанкам и хомякам. У последних часто развивается генерализованная инфекция.

58

Материалом для заражения служат клетками из язвы или из культуры. Лейшманий из культуры вводят внутрикожно. Через 10–20 дней на месте введения лейшманий развивается инфильтрат, содержащий стадии паразита.

Дифференциальная диагностика

проводится по следующему алгоритму:

Вопросы для самоконтроля:

1. Какие методы лабораторной диагностики лейшманиоза существуют?

2. В чем преимущества Иммуноферментного анализа?

3. В чем преимущество полимеразной цепной реакции?

4. Каким образом осуществляется культивирование лейшманий?

5. Какие животные подходят для биопробы?

59

9. ТЕРАПИЯ ЛЕЙШМАНИОЗА

Прогноз при кожном лейшманиозе благоприятный, при висцеральном и кожно-слизистом без лечения неблагоприятный. Ветеринарным и медицинским специалистам необходимо,однако, помнить, что даже своевременная диагностика и лечение не исключают летального исхода.

Немедикаментозное лечение

Постельный режим – до нормализации температуры, исчезновения симптомов интоксикации.Диета: общий стол (№ 15), обильное питье. При наличии сопутствующей патологии (сахарный диабет, заболевание почек и печени, и др.) назначают соответствующую диету.

Медикаментозное лечение

Лечение следует проводить только после подтверждения диагноза и под наблюдением медицинских либо ветеринарных специалистов.

Перечень основных лекарственных средств:

Противолейшманиозные препараты:

·соединения пятивалентной сурьмы: стибоглюконат натрия и меглуминантимониат, 20 мг Sb5+/кг в день, внутримышечно или внутривенно;

·липосомальныйамфотерицин В: 3–5 мг/кг – суточная доза, путем инфузии, в течение 3–6 дней до суммарной дозы 18–21 мг/кг;

·парамомицин, 15% мазь, наружно.

Перечень дополнительных лекарственных средств:

Противогрибковый препарат: ·флуконазол, 200 мг, внутрь.

60