730

животных. Ясные гранулемы обнаруживались исключительно, начиная с 35 дня. Клетки Купферапреобладали в незрелых гранулемах. Тем не менее, самая высокая экспрессия была обнаружена на 63 день после заражения. Положительное окрашивание на iNOS в основном наблюдалось в цитоплазме слитых клеток Купфера. Т-клетки (CD3+) и В-клетки (CD45R-B220+) преобладали на более поздних стадиях гранулемы, что, вероятно, связано с формированием приобретенного иммунитета. Нейтрофилы (Ly-6G+) преимущественно наблюдались в зрелых гранулемах. Количество нейтрофилов было ниже по сравнению с другими типами клеток, особенно в более поздние моменты времени [6].

Рис. 12. Биоптат костного мозга больного лейшманиозом ребенка. Окраска гематоксилином-эозином. Увел.Х100. (фото автора)

41

Рис.13. Биоптат костного мозга больного лейшманиозом ребенка. Окраска гематоксилином-эозином. Увел.Х400. (фото автора)

Вопросы для самоконтроля:

1. Каковы патологоанатомические изменения при кожном лейшманиозе?

2. Какие клетки составляют воспалительный инфильтрат?

3. Какие изменения выявляют в печени инфицированных лейшманиозом?

4. Что выявляют в клетках красного костного мозга при висцеральном лейшманиозе?

42

8. ДИАГНОСТИКА ЛЕЙШМАНИОЗА

Клинический диагноз устанавливают на основании эпидемиологических данных (пребывание в эндемичных районах, укусы москитов) и клинической картины болезни (кожные поражения, а при висцеральном лейшманиозе лихорадка, спленомегалия, характерные изменения в крови).

Для подтверждения диагноза используют паразитоскопию соскоба из края язвы или бугорка, при висцеральных формах – мазка и толстой капли крови, пунктата костного мозга, реже применяют посев на среду NNN, биопробу, а также РСК, РНИФ, ИФА.

При кожном лейшманиозе дифференциальный диагноз проводят с сифилисом, лепрой, трофическими язвами, раком кожи, при висцеральном – с малярией, бруцеллезом, сепсисом, лейкозом, лимфогранулематозом [1].

43

· факт пребывания больного в эндемических очагах лейшманиоза в сроки, укладывающиеся в инкубационный период.

Физикальное обследование

Висцеральный средиземноморско-азиатский лейшманиоз:

44

Стандартное определение случая висцерального лейшманиоза

Предположительный случай–тяжелое заболевание,

сопровождающееся высокой лихорадкой, выраженной интоксикацией и проявляющееся следующими клиническими

45

46

·возможен агранулоцитоз;

·гипергаммаглобулинемия.

Критическим моментом в постановке диагноза на лейшманиоз остается результат лабораторных исследований, которые могут быть выполнены методами микроскопии, культивирования, серологических реакций или полимеразной цепной реакции.

Микроскопия

При исследовании появившихся бугорков при кожном лейшманиозе протирают кожу спиртом и производят укол по направлению к середине бугорка. Лучше для взятия материала выбирать нераспавшиеся бугорки. Из выступившей капли серозно-кровянистой жидкости готовят на предметных стеклах мазки, высушивают, фильтруют и окрашивают. Необходимо, чтобы соскоб содержал в себе меньше крови и больше клеточных элементов инфильтрата.

При исследовании язвы с обильным отделяемым материал для исследования с поверхности брать не рекомендуется, так как обильная бактериальная флора и большое количество распавшихся клеток затемняют картину, поэтому материал берут путем пункции в приподнятый неизъязвившийся край язвы по направлению ко дну язвы. Из содержимого готовят мазки.

При висцеральном лейшманиозе исследованию подвергают пунктат костного мозга или увеличенного лимфатического узла, который получают под наркозом.

Костный мозг рекомендуется отбирать из большой берцовой кости. При этом животное фиксируют, кожу выбривают и тщательно дезинфицируют, производят разрез, очищают надкостницу и трепанируют кость тонкой дрелью. В полученное отверстие вводят затупленную иглу шприца и

47

аспирируют костный мозг. После процедуры рану ушивают и обрабатывают.

Также можно проводить биопсию костного мозга из грудины животного с использованием инфильтрационной анестезии.

Часть полученного пунктата костного мозга используют для приготовления мазков и микроскопии, другую часть можно использовать для посева на искусственные питательные среды.

Получение пунктата из селезенки или печени менее предпочтительно, так как в этих органах обнаруживается гораздо меньше лейшманий. В начальные сроки заболевания пригодны для диагностики также пунктаты из лимфатических узлов.

Приготовление мазков

Для приготовления окрашенного препарата можно также делать мазок-отпечаток, приложив обезжиренное предметное стекло к пораженной ткани. Мазок сушат на воздухе при комнатной температуре, защищая от попадания пыли, прямых солнечных лучей или насекомых. Высушенные мазки фиксируют одним из методов.

Для фиксации можно использовать метиловый спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова (спирт пополам с эфиром), нанося их на мазок до полного высыхания. Также применяют раствор метиленового синего по МайГрюнвальду, содержащий метиловый спирт, в течение 1 минуты. После фиксации мазки окрашивают.

Существует несколько способов окраски, подходящих для исследования простейших: Романовского-Гимза, Паппенгейма, а также Лейшмана. Ниже описаны наиболее доступные методы.

48

Окраска по Романовскому-Гимзе

Для этого используют готовую краску азура и эозина, которую перед применением разводят фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) в соотношении 1:9 и наносят на фиксированный и промытый мазок на 15 минут, после чего мазок отмывают от излишков краски, сушат и микроскопируют.

Окраска Лейко-Диф

В последние годы часто для быстрого окрашивания препаратов клеток используют готовые наборы, например,

Лейкодиф 200 (PLIVA-LachemaDiagnostika, Чешская Республика). С помощью данного набора получение окрашенных препаратов происходит за несколько секунд.

Сущность метода заключается в погружении стекла с высушенным мазком несколько раз на 1 секунду последовательно в три раствора. Первый – фиксатор (метанол и нафталиновый зеленый), мазок фиксируют погружением 5 раз. После каждого погружения дают возможность стечь раствору и его избыток устраняют о край сосуда. Второй раствор – эозин в фосфатном буфере, фиксированный мазок погружают на 1 сек. 3 раза. Третий раствор – Азур II в фосфатном буфере, мазок погружают 6 раз, избыток краски устраняют о край сосуда и промывают фосфатным буфером рН 7,2, после чего сушат и микроскопируют как обычно.

Окраска по Лейшману

Высушенные нефиксированные мазки окрашивают краской Лейшмана 1–3 минуты, после чего промывают водопроводной водой. Затем препараты окрашивают свежеприготовленным красителем, содержащим азур, эозин, дистиллированную воду в соотношении 4:3:7 в течение 30 минут. После окрашивания мазки промывают водопроводной водой и высушивают, а затем микроскопируют, как обычно.

49

Культивирование

Часть А:

Приготовление

Размешать 31,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121 С)

50