книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

трое суток. Если же колбы сразу ставились при температуре

12 час. колбы взвешивались и определялось количество выделив­ шейся углекислоты. После окончания брожения фильтрованием отделялась твердая часть, а в фильтрате определялись: плот­ ность среды по Бал., кислотность в °Д*, спирт, редуцирующие вещества (остаточный сахар) до и после гидролиза. В конце

брожения проводились также микроскопические наблюдения

над состоянием дрожжей, в некоторых опытах подсчитывалось количество дрожжевых клеток.

В общей сложности проведено по три—пять опытов броже­ ния по каждому варианту осахаривания: ячменным солодом,

препаратами грибов Asp. niger, Asp. oryzae, Rh. delemar.

В таблицах приводятся средние показатели, полученные при анализе двух или четырех параллельных сосудов.

Полузаводские опыты по сбраживанию древесных гидроли­ затов термофильными дрожжами ставились в чанах емко­ стью 1 —1,5 м3..

Опыты были проведены методом периодического брожения с последующей сепарацией жидкой части среды после бро­ жения и методом непрерывного брожения.

В качестве контроля служили лабораторные опыты по сравнительному сбраживанию гидролизного сусла как термо­

фильными, так и заводскими дрожжами при установленных температурах брожения. Кроме этого, для сравнения были использованы средние заводские показатели по брожению.

КРАТКОВРЕМЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ НА ДРОЖЖИ ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ

Скорость возникновения адаптивных модификаций

Прежде чем приступить к длительным опытам по адаптации дрожжей к повышенной температуре, необходимо было выяс­ нить, с какой скоростью могут возникать адаптивные модифика­ ции у дрожжей под влиянием этого фактора в дозах, не являю­ щихся для них губительными.

Для получения адаптивных вариантов исходная культура дрожжей подвергалась кратковременному действию постепенно повышаемой температуры. При таких условиях должны были появиться, как мы предполагали, адаптивные модификации с повышенной устойчивостью к температурному фактору.

1 Градусы Дельбрюка — количество раствора щелочи, использован­ ное для нейтрализации 20 мл среды.

69

В наших первых изысканиях и работах по приучению к повышенным температурам культур дрожжевых микроорганиз­ мов мы использовали ценные в методическом отношении сведе­ ния, сообщаемые Дудоровым и Хальтереном.

Дудоров проводил свои опыты с Escherichia coli. Клетки

этой бактерии были приучены и сохраняли жизнеспособность в присутствии 3% NaCl в питательной среде. Однако быстрое перенесение в более концентрированные растворы NaCl они

переносили хуже (Doudoroff, 1940). Если же эти бактерии вы­

держивать в течение 60—90 мин. в растворах с постепенно повышаемой концентрацией поваренной соли, то при последу­

ющем их пересеве в среды с еще более высоким содержанием NaCl

количество жизнеспособных клеток значительно увеличивалось.

Хальтерен (Halteren, 1950), выдерживая в течение одного

часа суспензии дрожжей Sacch. cerevisiae при 47° и Torula utilis при 44°, наблюдал явление температурного шока. Если после воздействия такой температурой дрожжи перевести в обычные условия (30°) и к среде добавить аммонийные соли или аминокислоты из расчета 50 иг азота на 1 мл, т. е. в коли­ честве, равном среднему содержанию азота в дрожжах, то по­ требление клетками кислорода снижалось на 40—60%.

Хальтерен изучал в дальнейшем условия, необходимые для

возобновления ассимиляции азота. Как было им показано,

дрожжи должны находиться после температурного шока 2— 3 часа при 30°. При этом обязательно присутствие вереде

глюкозы или другого энергетического материала.

Приведенные работы указывали на то,что для получения адап­ тивных модификаций целесообразнее воздействовать на дрожжи посредством последовательногоповышения температуры, но не пе­ реносить их сразу в условия сравнительно высокой температуры.

Эти опыты были проведены с двумя культурами дрожжей: Sacch. cerevisiae XII расой и дрожжеподобным организмом Toralopsis latvica. Последний использовался для сравнения как аспорогенный и не имеющий полового процесса. Вторая культура, как и первая, была выделена из одной клетки.

Вначале была найдена предельная (максимальная) темпе­ ратура, выше которой рост дрожжей приостанавливался.

С этой целью солодовое сусло 7° Бал. сбраживалось дрожжами Sacch. cerevisiae XII расой при различной температуре: 35— 37—40 и 42°. Повышение температуры на 5 и 7° сверх оптималь­ ной не вызывало заметного отклонения от нормального разви­ тия дрожжей, в то время как при 40° наблюдалось резкое угне­ тение размножения. При температуре 42° размножение дрожжей и брожение полностью приостанавливались.

Для получения адаптивных вариантов двухсуточная культура дрожжей подвергалась кратковременному воздей­

70

ствию постепенно повышаемой температурой, а затем произво­ дился высев на сусло-агаровую среду при 39—40°. Для этого предварительно готовилась взвесь дрожжевых клеток на сте­

рильной водопроводной воде и из четвертого или пятого раз­

ведения вносилось по 1 мл такой суспензии клеток в пробирки с 9 мл стерильной водопроводной воды. В опыт бралось по две параллельных пробирки.

Дрожжевая суспензия в первой пробирке была подвергну­

та действию постепенно повышаемой температуры — сначала

при 34° в течение 30 мин., затем при 36 и 38° (тоже по 30 мин.). Дрожжи во второй пробирке служили контролем и выдер­ живались в водопроводной воде при комнатной температуре в течение этого же времени (90 мин.). Затем как из опытной, так и из контрольной пробирок делался высев на сусло-агар, в чашки Петри, которые после этого помещались в термостат на двое-трое суток при температуре 39—41°. Спустя указанный

срок определялось число выросших колоний и производились

71

Кратковременное действие на дрожжи постепенно повыша­ емой температуры увеличивает число особей, способных раз­ виваться при температуре, резко повышенной против обычного оптимума.

Доказательством в пользу этого положения служит ко­ личество выросших колоний после высева на плотные среды прогретой опытной суспензии. С повышением температуры

прорастания колоний число их заметно возрастает. Однако при 42°, несмотря на довольно большое количество, эти коло­ нии меньше по величине и с коричневатым оттенком. Клетки дрожжей контрольных суспензий при этой температуре вообще не вырастали. Когда такие чашки Петри ставились в термостат

сболее низкой температурой (39°), то рост колоний наблюдал­ ся. Их было тем не менее значительно меньше, чем в чашках

сопытной суспензией после выдерживания ее при повышен­ ной температуре.

Ниже приводятся данные одного из опытов, где посев на чашки Петри был произведен одним и тем же количеством дрож­ жевой взвеси, предварительно прогретой указанным способом и не прогретой. Чашки ставились в термостат при различной температуре (табл. 2).

Таблица 2

Влияние кратковременного прогрева 'дрожжей

Таким образом, описанные опыты свидетельствуют о том,

что непродолжительное воздействие на дрожжи постепенно повышаемой температурой способствует более интенсивному их развитию при высоких температурах. На рис. 1 и 2 пока­ зано количество выросших на чашках Петри колоний дрожжей после высева предварительно прогретой и непрогретой сус­ пензии.

В дальнейшем предполагалось выяснить основной прин­ ципиальный вопрос: имеется в данном случае изменчивость

72

клеток под воздействием высокой температуры или же здесь,

происходит просто отбор наиболее терморезистентных особей, ранее имевшихся в популяции.

Чтобы исключить возможное размножение клеток дрожжей во время прогревания суспензии в течение 90 мин., производил­

ся подсчет клеток до и после температурного воздействия.

С этой же целью в некоторых опытах подсчитывался процент почкующихся клеток.

Были также проведены специальные наблюдения над состоя­ нием почкующихся клеток в висячей капле при исследуемых

температурах. Кроме этого, был произведен высев на чашки

Петри одного и того же количества клеток дрожжей без прогре­ вания и после предварительного прогревания. Чашки помеща­

лись в термостат при нормальной температуре (30°).

По количеству выросших колоний можно было судить об отсутствии размножения у дрожжей в процессе нагревания. Применяемые же условия предварительной температурной обработки не должны были оказывать на дрожжи угнетающего действия; число выросших на чашках Петри колоний в обо­ их случаях зависело только от числа клеток, внесенных при

73

Рис. 1. Колонии дрожжей Saccharomyces cerevisiae

XII расы, выросшие при температуре 39—40°

Дрожжи перед высевом на чашки Петри: а — не прогревались; б — подвергались действию повышенной температуры

74

Таблица 4

Число почкующихся клеток дрожжей Saccharomyces

Таким образом, большое число проведенных опытов пол­

ностью исключает размножение клеток дрожжей за время прогревания суспензий — 90 мин. — при 34, 36 и 38°.

Наблюдения за почкующимися клетками в висячей капле указали и на абсолютную неспособность почек отделяться от материнской клетки, независимо от их возраста. Так, в опытах с высевом дрожжей на чашки Петри число выросших при

30° колоний было одинаковым и с контрольной, и с опытной

Форма колоний была совершенно одинаковой как у дрож­ жей, подвергнутых температурному воздействию, так и у кон­ трольных. Они были круглые, с ровными краями, желтоватого

76

оттенка. От колоний дрожжей, выращенных в нормальных температурных условиях, первые отличались значительно мень­ шей величиной. Так,'большинство колоний после высева пред­ варительно прогретой суспензии дрожжей имело диаметр 0,3 мм. Реже встречались колонии большего размера — 2 мм.

Еще более мелкие колонии наблюдаются в тех случаях, когда дрожжи без предварительной обработки выращивались при 39—40°.

Влияние кратковременного действия температуры на форме клеток почти не сказалось. Отличие выражалось лишь в том,

что у дрожжей, не подвергавшихся воздействию температуры,

чаще встречались клетки увеличенного размера. Крупные дрожжевые клетки имели большую вакуоль, занимающую почти всю клетку, протоплазма была мелкозернистая и при­

легала к стенке клетки. Реже встречались плазмолизирован­

ные дрожжи с крупнозернистой протоплазмой. У таких клеток наблюдалась повышенная проницаемость к краскам. Попада­

лись клетки с лопнувшей оболочкой и вышедшим наружу со­ держимым.

В клетках содержалось много жира. Метахроматина и гликогена было меньше, чем в контрольных после высева па плотные среды.

Аналогичные морфологические изменения наблюдались и у

Torulopsis latvica.

Большое число вырастающих колоний из клеток, которые

предварительно нагревались, совершенно ясно указывало на появление адаптивных изменений под влиянием даже такого относительно кратковременного (в течение 90 мин.) воздейст­ вия повышенной температурой.

Однако укорочение указанного срока обработки наполовину уже не вызывало появления измененных клеток.

Пассажи адаптивных вариантов при высокой температуре

Нас интересовал вопрос, может ли такая кратковременная

температурная обработка дрожжей (в течение 90 мин.) сказать­ ся в какой-либо степени и в последующих поколениях, при дальнейшем их культивировании при 39—40°.

Для выяснения этого вопроса дрожжи, подвергнутые нагре­ ванию, как обычно, поддерживались и дальше при температуре 39—40°. Затем после третьего и четвертого пассажей был

сделан высев их на чашки Петри и снова произведен подсчет колоний. Оказалось, что и в последующих поколениях (табл. 6)

дрожжи, подвергнутые нагреванию, размножались более энергично и, таким образом, количественные различия сохраня­ лись.

77

Следовательно, такой непродолжительный температурный «удар» по клеткам способствует более быстрой их адаптации при дальнейших пассажах при повышенной температуре.

Влияние кратковременного нагрева клеток на их бродильную способность

В дальнейшем мы перешли к изучению влияния кратковре­ менной температурной обработки на бродильную функцию дрожжей. С этой целью они подвергались обработке, как это было описано выше.

После выращивания на чашках Петри при температуре

40° в течение двух суток дрожжи смывались стерильной водо­ проводной водой и отпрессовывались.

Брожение проводилось в трубках Клёйвера при темпера­ туре 39—40° на сахаро-фосфатном растворе (4% свежеотпрес-

сованных дрожжей, 4% сахарозы, фосфатный буферный раствор по Михаелису концентрации V20 М, pH = 5,5). Продолжитель­

ность брожения 2—3 часа.

Как видно из табл. 7 и рис. 3, брожение при повышенной температуре протекает интенсивней с дрожжами, которые предварительно подвергались кратковременному действию по­ вышенной температуры. Количество выделившейся углекисло­ ты по сравнению с контролем было больше на 11—12%. Таким образом, у опытных дрожжей не только скорость размножения,

78