книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

кислот, витаминов и близких им соединений. Такие организмы,

полностью утратившие способность к синтезу того или иного

витамина, или другого ростового вещества, используются в качестве индикаторов при количественном определении этих соединений.

Несмотря на случайный характер многочисленных мута­

ций, возникающих после облучения, пользуясь средами опре­ деленного состава, возможно отобрать варианты с теми или иными наследственно закрепленными свойствами. Если нам будет известно, какое именно звено у организма поражается при определенной силе воздействующего фактора, то удастся изменять свойства микроорганизмов в интересующем направ­ лении.

Так, например, если бы мы смогли у дрожжей прервать цепь, идущую от пировиноградной кислоты к циклу трикарбо­ новых кислот, то образование жирных кислот, в частности эргостерина, значительно усиливалось бы. Этот механизм направленного усиления синтеза жирных кислот и эргостерина в клетках дрожжей был выяснен Мейселем и его сотрудниками (Мейсель, Ремезова, Гальцова, Медведева, Помощникова, Шаль-

нова и Алексеева, 1955).

Случай получения термоустойчивых мутантов при воздей­ ствии на культуры ультрафиолетовыми лучами описан в работе Горовица и Леупольда (Horowitz u. Leupold, 1951). Посред­ ством воздействия ультрафиолетовыми лучами на мезофильные формы Neurospora, также Е. coli и при последующем размно­ жении облученной популяции при повышенной температуре были получены термофильные варианты этих микробов. Чаще получались мутанты с утратой способности к синтезу какоголибо фактора роста, например триптофана и />-аминобензойной

кислоты.

Применение лучистой энергии для получения мутантов микроорганизмов, дефицитных в отношении синтеза того или

иного вещества, имеет большое практическое значение. Такие

индикаторные культуры смогут найти применение в самых различных областях знания.

В последние годы проводятся широкие исследования по изучению изменчивости бактерий под влиянием специфических фагов. В частности Ларк и Адамс (Lark a. Adams, 1953) полу­

чали под влиянием фага Т8 мутанты Е. coli. Они были во много раз более устойчивы к нагреванию, чем исходные штаммы.

Не менее интересно выяснить возможность использования метода половой гибридизации для получения терморезистент­ ных форм микроорганизмов, обладающих половым процессом.

Метод половой гибридизации был успешно использован Косиковым в отношении дрожжей (1948, 1950, 1951а, б, 1952,

39

1956 а, б). Косиков вывел гибриды, различающиеся по фермен­ тативным свойствам. Полученные культуры, способные сбра­ живать определенные сахара, внедрены в бродильную про­ мышленность. Так, были получены и применены гибриды, сбраживающие мальтозу, но не сбраживающие сахарозу, для приготовления бархатного или карамельного пива.

За последний период времени в изучении обмена веществ

вариантов с желаемыми свойствами.

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Термофильные микроорганизмы все больше и больше на­ ходят применение в промышленности и сельском хозяйстве. Ведение биохимических процессов при высоких температурах способствует их ускорению, увеличению выхода продуктов и делает эти процессы в экономическом отношении более выгод­ ными .

Касаясь использования термофильных бактерий, интересно

назвать фермент супербиолазу, продуцируемый клетками Вас. diastaticus. Препарат был применен в текстильной промыш­

ленности для расшлихтовки тканей (Имшенецкий, Солнцева и

Броцкая, 1943; Имшенецкий, 1944).

Термофильный вариант анаэробной бактерии из группы

Clostridium. Pastorianum, выделенный в Институте микпобиологии АН СССР, может быть также использован для получения активной амилазы. Амилаза, получаемая из этой бактерии, оказалась пригодной для расшлихтовки ткани из искусствен­ ного шелка (Фениксова и Кинсбурская, 1954).

В последние годы в Советском Союзе проводятся широкие

Повышенная температура брожения (35—36°) применяется большинством спиртовых заводов по переработке мелассы на спирт. Использована термостабильная культура дрожжей вида

Sacch. cerevisiae раса «Я». Процесс брожения при указанной температуре протекает значительно быстрее (Марксон, 1936).

В связи с применением в спиртовой промышленности гриб­ ных диастатических ферментов открываются большие перспек­

тивы для внедрения термофильных рас дрожжей. Амилолити­ ческие ферменты ячменного солода, как выясняется, не произ­

водят полного расщепления декстринов. При использовании

40

ферментов плесневого гриба Aspergillus niger достигается не

только более полное осахаривание. На конечном этапе осахари­ вания, которое проходит в процессе брожения, амилолитиче­

ские ферменты Asp. niger не разрушаются при повышенной температуре брожения (37—38°). Это дает возможность при­ менять для брожения термофильные расы дрожжей.

Пен, Андреасен и Колачов (Pan, Andreasen a. Colachov, 1950), осахаривая зерновые заторы ферментами плесневого

гриба Asp. niger, использовали обычную культуру дрожжей, однако в конце брожения они поднимали температуру до 37°.

Работами Р. В. Фениксовой, Л. Г. Логиновой и А. А. Шило­ вой (1956) была показана полная возможность применения тер­

мофильных вариантов дрожжей для сбраживания зерновых заторов после осахаривания их амилолитическими ферментами грибов Asp. niger и Rhizopus delemar. Термофильные расы дрожжей при сбраживании сульфитных щелоков и древесных

Имеются указания об использовании термофильных дрож­

жей в хлебопекарной промышленности. Саруханян и Севоян

(1955) выделили из хлебных заквасок культуру вида Sacch. cerevisiae. Она была затем адаптирована к постепенно повышае­ мой температуре. В дальнейшем удалось получить из нее тер­ моустойчивые варианты дрожжей. Они успешно применяются на хлебопекарных заводах.

В этой же отрасли промышленности нашли широкое при­

менение и термофильные молочнокислые бактерии типа Bact. delbriicki для подкисления заторов при получении жидких дрожжей (Баширова, 1958). При этом удалось сократить пе­ риод молочнокислого брожения до 6—8 час., одновременно было уменьшено количество вносимой закваски на 10—15%. Выделенная форма (штамм Э-1) являлась энергичным кислото-

образователем. Ее оптимальная температура брожения 45—52°. В молочной промышленности Ольшанский, Проке, Каван

и Хладилова (Olsfnky, Proks, Kavan i Chladilova, 1956) при­ меняли термофильные культуры Streptococcus thermophilus и варианты Lactobacillus lactis, L. helveticus для получения высо­ кокачественного творога.

В более ранних исследованиях Шапошникову и Мантей­ фель (19236) удалось выделить из ржаной и солодовой муки культуры Вас. acidificans longissimus (Lafar) и Bact. delbriicki

(Leichmann), которые энергично развивались и накапливали молочную кислоту при температуре 48—50°. Максимальная температура роста была 56°. Они успешно использовались в производстве.

41

В самое последнее время делаются попытки выделить анти­ биотические вещества из различных групп термофильных микро­ организмов (Красильников, 1949; Мишустин, 1950; Pickenhain, 1953; Космачев, 1956). Решение этого вопроса представляет ин­ терес не только для медицины, но и для сельского хозяйства.

Примеров успешного использования термофильных микро­ организмов с практическими целями можно было бы привести

множество.

Они все больше и больше находят применение в сельском

хозяйстве — при переработке ojiriyari'/eg^p^ удобрений, очи­ стке сточных вод, а также при ^ыийтаже’нйн ш обезвреживании городских отбросов (Мишустин, 1950; Евреинова, Юкельсон

иХромова, 1954).

1ермофильные бактерии (В. thermophilus, В. aerothermophi­ lus, В. thermoacidurans) способны осуществлять процессы де­ заминирования окислительным путем (Chopra, 1945а,Ъ). По­ этому роль термофильных микроорганизмов весьма значитель­ на в различных биологических процессах, протекающих при высоких температурах. Они участвуют в силосовании кормов,

вбиологической очистке сточных вод и т. д.

Представляет большой интерес применение термофильных бактерий при сбраживании целлюлозы в целях использования растительных отходов (Первозванский и Чельцова, 1935, 1936;

Первозванскпй и Семенова 1, 1937; Логинова, 1937; Первозван­ ский и Королев, 1937; Первозванский и Залесская, 1937; Чель­ цова, 1937, 1939; Чельцова, Логинова и Быкова, 1938; Ротмист­

ров, 1940, 1958).

Возбудители термофильного целлюлозного брожения на­ ходят применение также при выделении каучука из корней каучуконосов.

Указывая на ценность термофилов, нельзя не упомянуть и о вреде, причиняемом сельскому хозяйству этими микроор­

ганизмами. 3 ак, известны случаи саморазогревания зерна, сена,

торфа, угля, вызываемого термофильными бактериями (Исаченко, 1934; Исаченко и сотр., 1934,1936; Раутенштейн, 1939 а, б и др.).

Многие термофильные организмы, а также некоторые тер­ моустойчивые мезофильные формы могут сохранять жизнеспо­ собность при консервировании продуктов и, таким образом, причинять вред. В их число входят самые разнообразные фор­

мы аэробных, факультативно-аэробных и анаэробных бактерий.

Некоторые из них успешно переносят автоклавирование в те­ чение 30 мин. и свыше.

В литературе широко освещены работы по изучению устой­ чивости к нагреванию спор различных видов бактерий. Состав

1 Л. Г. Семенова— Л. Г. Логинова.

42

среды, как было показано, играет существенную роль в сохра нении жизнеспособности спор при их нагревании.

Для разработки надежных методов стерилизации пищевых продуктов большое значение имеет поэтому более глубокое изучение терморезистентности спор различных групп споро­ носных бактерий.

Влияния состава среды на устойчивость спор к нагреванию касаются в своих работах А. И. Рогачева (1947, 1950), Рид,

Борер и Камерон (Reed, Bohrer a. Cameron, 1951), Мейер, Малгра и Аладам (Meyer, Malgras et Aladame, 1952), Амаха (Amaha, 1952 a, b, с), Вильямс и Робертсон (Williams a. Robertson,

1954), Амаха и Сакагучи (Amaha a. Sakaguchi, 1951, 1952), Эль-Бизи и Ордейль (El-Bisi a. Ofdal, 1956), Амаха, Ордейль и Тоуба (Amaha, Ordal a. Touba, 1956).

МЕХАНИЗМ АДАПТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ У МИКРООРГАНИЗМОВ

Биологический механизм

В этом разделе изложены теории возникновения адаптив­ ных изменений у микроорганизмов, а также даны объяснения механизма появления этих изменений.

Как явствует из рассмотрения существующих взглядов по вопросу изменчивости и наследственности микроорганизмов, единства в понимании механизма адаптивных изменений еще нет. Не отвергая возможности возникновения изменений путем мутаций (что можно наблюдать, например, при действии лучи­ стой энергии), следует признать адаптивный в большинстве случаев характер происходящих изменений. Это положение подтверждает накопленный фактический материал.

Лурия (Luria, 1947), Демерец (Demerec, 1945, 1948, 1951, 1957), Брайзон и Демерец (Bryson a. Demerec, 1950), В. Браун

(W. Braun, 1953), Дж. Ледерберг и Е. Ледерберг (J. Lederberg а.

Е. Lederberg, 1952), Кавалли-Сфорца и Дж. Ледерберг (CavalliSforza a. J. Lederberg, 1956) объясняют все случаи адаптивных изменений у микробов только спонтанными мутациями. Под спонтанными мутациями подразумеваются случайные измене­ ния наследственных свойств клетки, которые находятся под контролем генов.

Мутационные изменения у микроорганизмов наблюдаются исключительно редко (частота мутаций равна! хЮ'9—1 хЮ-10)- Как считают, внешние факторы могут вызвать лишь ускорение мутаций, а также различные, легко обратимые, ненаследствен­

ные фенотипические изменения. При этом допускается, что наследственные изменения могут быть связаны не только с ядром, но и с цитоплазмой клетки.

43

В качестве известного примера цитоплазматической измен­ чивости обычно приводятся работы Эфрусси, Готтингера и

подвергая дрожжи Sacch. cerevisiae воздействию акрифлавина,

получили варианты, образующие карликовые колонии. Не­ большая величина колоний была связана с повреждением цито­ хромоксидазной системы. Эта ферментная система, как было

показано, локализуется в митохондриях. Наблюдаемые изме­

нения происходили у большинства клеток и носили наслед­ ственный характер.

Закже было установлено, что при скрещивании обычных дрожжей с формами, образующими карликовые колонии, про­ исходила передача по наследству способности к синтезу цито-

хромоксидазы. Эта передача осуществлялась при помощи

цитоплазматических частиц.

По мнению всех упоминаемых здесь авторов, при последо­ вательных пересевах культуры микробов с возрастающей кон­

центрацией воздействующего фактора (например, яда) проис­ ходит ряд многоступенчатых мутаций. Это будет приводить к постепенному повышению уровня резистентности в отно­ шении данного фактора. Утрата наследованного организмом

свойства объясняется обратной мутацией (Atkin, Moses а.

Gray, 1949; Barer, 1951 и др.).

Постепенное возрастание резистентности может быть с тем же правом объяснено, однако, и влиянием нового фактора среды.

Для доказательства того, что в популяции бактерий всегда содержится некоторое число клеток, устойчивых к данному агенту, широко используется метод отпечатков (replica plating),

предложенный Дж. Ледербергом и Е. Ледерберг (1952), и ме­

тод разведений, разработанный Кавалли-Сфорца и Дж. Ле­ дербергом (1956).

Таким путем были выделены штаммы Е. coli, устойчивые к стрептомицину, хлорамфениколу и бактериофагу, из культур, не подвергавшихся действию этих агентов.

Одной из слабых сторон методов, предложенных для отбора мутантных форм, устойчивых к тому или иному веществу, яв­ ляется низкая концентрация его в среде, при которой возмож­ но развитие этих мутантов. Так, например, была отобрана форма, развивающаяся на среде с содержанием в 1 мл ее 100—

200 рг стрептомицина. Между тем методом постепенной адапта­ ции к стрептомицину можно было достигнуть повышения рези­ стентности в 25 000 раз.

При помощи методов отпечатков и разведений были также получены формы Е. coli, переносящие до 35 мг хлорамфеникола

44

в 1 л среды. Дин и Хиншельвуд (Dean a. Hinshelwood, 1957),

применяя метод постепенной адаптации Е. coli к хлорамфени­ колу, получили форму, резистентную к 1100 мг этого вещества

в1 л среды.

Вкультурах Е. coli и стафилококка встречаются особи с

разной чувствительностью к антибиотику гризеину (Мороз,

1956).

Совершенно очевидно, что в исследованиях, в которых до­

казывается возможность спонтанного возникновения в микроб­

ной популяции мутаций, устойчивых к различным факторам среды, необходимо было предварительно выяснить степень

чувствительности различных клеток бактериальной культуры к действующему фактору. К сожалению, это часто исследова­

телями не выполняется.

Измененные формы обнаруживаются только после опреде­ ленного периода культивирования в новых условиях. По мне­ нию многих, это служит доказательством направленного дей­ ствия среды и перестройки при этом обмена веществ микроор­ ганизма.

Так, например, клетки Bact. lactis aerogenes, способные раз­ виваться в среде со стрептомицином, имеют длительный лагпериод; в течение его могут происходить их изменения (Barer,

1951).

Как считает Барер, приучение бактерий к стрептомицину обусловливается двумя процессами: с одной стороны, измен­

чивостью, с другой — отбором клеток, устойчивых к указан­

ному антибиотику.

Банич. (Banic, 1954) посредством выращивания чувствитель­

ного к пенициллину штамма Staphylococcus aureus на среде, со­ держащей пенициллин, получил формы, резистентные к этому веществу. Резистентные формы возникали не сразу, а после длительного периода культивирования. Продолжительность этого периода зависела от особенностей самого организма, доз антибиотика, а также и от других условий. По мнению автора, резистентные к пенициллину формы возникли в результате адаптации, а не предсуществовали в популяции.

При адаптации Bact. lactis aerogenes к а-арабинозе Баскетт и Хиншельвуд (Basket! a. Hinshelwood, 1951) вначале наблюдали довольно значительный лаг-период, прежде чем культура на­

чинала развиваться; в дальнейшем этот период постепенно уменьшался по мере адаптации микроба к среде с указанным веществом.

Аналогичные результаты получены при адаптации Bact. coli mutabile к лактозе. В работах Хиншельвуда и его сотруд­ ников (Dean a. Hinshelwood, 1954 а, Ь) показано, что адапта­

ция культуры к трудноусвояемым сахарам, а также повышение

45

устойчивости к яду зависят главным образом от изменения об­ мена веществ большинства клеток, а не от отбора единичных спонтанных мутаций.

Наблюдающиеся в процессе постепенной адаптации изме­ нения происходят обычно у большинства клеток популяции. Согласно же мутационной теории, появление мутаций наблю­ дается у весьма ограниченного числа особей.

По данным Акибы (Akiba, 1955) и Шибальского (Szybalski, 1954 — 1955), не только большинство клеток, но и практически все клетки Е. coll, подвергавшиеся воздействию стрептоми­ цина, приобрели устойчивость к этому антибиотику.

Некоторые исследователи, разделяя основные положения сторонников теории спонтанного возникновения измененных

форм микробов, все же считают, что многие изменения могут

происходить и под влиянием внешних условий жизни. Эти из­ менения, однако, не носят наследственного характера (Sonneborn, 1950, 1951; М. Gibson a. S. Gibson, 1951; Eagle, Fleischman a. Levy, 1952; Stanier, 1953).

Другие не отрицают возможности получения стойких на­

следственных изменений адаптивного характера fl hornley,

Sinai a. Yudkin, 1957; Barber, 1957), но эти изменения, по их мнению, наблюдаются редко. Хиншельвуд и его сотрудники

(Davies, Hinshelwood a. Pryce, 1945; Dean a. Hinshelwood, 1954,

а, b), признавая роль прямых адаптивных изменений в явле­ ниях изменчивости, находят, однако, эти изменения нестой­ кими. По их мнению, возникшие новые свойства утрачиваются, когда действующий фактор выводится из среды, и в большин­ стве случаев эти изменения носят характер длительных моди­ фикаций. Так, Дин и Хиншельвуд адаптировали Aerobacter aerogenes к высоким концентрациям профлавина, прокамидина и хлорамфеникола. Были получены формы, устойчивые к этим веществам. Приобретенное свойство удерживалось в течение многих генераций (около 1000) при культивировании на средах в присутствии яда. Однако, когда пересевы велись на среде без яда, то эта устойчивость терялась.

Соглашаясь с Хиншельвудом в вопросе о том, что адаптив­ ные изменения главным образом происходят под влиянием воз­ действия внешнего фактора, нельзя принять его второе поло­

жение, согласно которому вызванные этим фактором изменения

умикробов не могут наследоваться.

Вотношении наследственных изменений, наблюдаемых у

микроорганизмов под действием высоких температур, имеется также две точки зрения. По мнению Лиске (1921), Магуна (1926а), Клёйвера и Баарса (1932), Аллен (1953), Смита и Гордона (Smith a. Gordon, 1955), высокая температура играет роль селектив­ ного фактора, ив этих условиях механически отбираются устой­

46

чивые к данному фактору клетки. При этом новые свойства возникают спонтанно, независимо от внешней среды.

Однако многочисленные исследования свидетельствуют о том, что при культивировании микроорганизмов в условиях повышающихся температур у них постепенно усиливается резистентность (Имшенецкий, 1944; Hinshelwood, 1946; Логи­ нова, 1948; Мишустин, 1950; Bilimoria a. Bhat, 1954; Fang,

Tang, Isai a. Wu, 1956).

Возникшее в процессе адаптации новое свойство — способ­ ность развиваться при более высокой температуре — большей частью наследуется.

В настоящее время накоплен уже значительный фактический материал, доказывающий возможность путем адаптации к самым

различным факторам внешней среды (химическим, физическим и биологическим) получать наследственно измененные формы микробов, способные существовать в новых условиях жизни.

Работы по изменчивости ферментативных свойств дрожжей

(Кудрявцев, 1938, 1939, 1954; Косиков, 1950, 1952,1954; Комаро­ ва, 1951; Карасевич, 1958), по адаптации к ядовитым веществам

(Квасников, 1938, 1952; Логинова, 1939,1941, 1951; Саенко, 1950, 1952 а, б; Шамис, 1951; Имшенецкий и Перова, 1954, 1955.

1957; Иерусалимский, 1957а; Пинаева, 1957; Лозинов и Ерма-

ченко, 1957), к температурному фактору (Имшенецкий и Ло­ гинова, 1944; Логинова, 1948) и другие рассматриваются как примеры адаптивной изменчивости, которая в большинстве случаев носит наследственный характер.

На первых этапах приспособления микроорганизмов к но­ вым условиям среды приобретенные признаки нестойки и

могут легко исчезнуть. Однако при длительном культивиро­ вании микроорганизмов под постоянным воздействием данного фактора эти признаки становятся устойчивыми и могут закре­ питься наследственно (Имшенецкий, 1946,1949, 1956; Кудрявцев, 1951,1952, 1954; Тимаков, 1952; Иерусалимский, 1952,1957 а, б).

Таким образом, для закрепления вновь приобретенного свойства микробов требуется длительное время.

по отношению к воздействующему фактору (Gale a. Rodwell,

1949; English a. McCoy, 1951).

Мы располагаем теперь возможностью без труда получать

47

адаптированные к тому или иному новому фактору среды фор­ мы, а также добиться усиления определенных свойств микроба. Однако было бы неправильно утверждать, что любой орга­ низм может быть приспособлен к любым условиям существо­

вания. Возможность к адаптации у микроорганизмов обуслов­ лена структурно-функциональными возможностями их клеток.

Так, Хиншельвуду (1944) не удалось усилить устойчи­

вость у Bad. ladis aerogenes к фенолу, хотя этот организм мог быть адаптирован к другим ядам. Кобэрн и Вильсон (Coburn a. Wilson, 1950) не смогли повысить устойчивость к сульфона­ миду у штаммов гемолитических стафилококков.

Однако Имшенецкий (1957) придает большое значение среде и высказывает предположение, что скорость приучения в боль­ шей степени определяется особенностями действующего фак­ тора (т. е. среды) и в меньшей степени систематическим поло­ жением микроорганизмов.

Возможны изменения, когда затрагивается и изменяется наследственная основа организма. Это может происходить при воздействии на микроорганизмы резко измененными условиями существования. Такие изменения могут привести или к гибели организма, или вызвать изменение его наследственности. При этом одновременно с процессом отбора, который протекает среди особей различной чувствительности к воздействующему новому фактору среды, протекает и процесс адаптации микро­ организмов к измененным условиям среды. Таким образом, зна­ чение внешних условий в формообразовании микробов весьма велико (Имшенецкий, 1952, 1957; Иерусалимский, 1951, 1952а, б, в, 1957 а, б; Тимаков, 1952; Тимаков и Скавронская, 1956а, б; Кудрявцев, 1954, и др.).

Наглядным примером направленного действия среды могут служить опыты Мейселя (1932), Стира и Кастора (Stier a. Cas­ tor, 1941): при культивировании дрожжей в присутствии циа­

нистого калия удалось резко снизить энергию дыхания. Пони­

женная активность дыхания была связана, как показали Стир и Кастор, с утратой ферментов цитохромной системы. Однако в процессе приспособления развивается другой механизм, свя­ занный с увеличением количества флавина.

Слонимский (1956) культивировал дрожжи Sacch. cerevisiae в условиях повышенной аэрации длительное время. Ему

удалось получить вариант, более энергично развивающийся в этих условиях, чем исходная культура. Это свойство оказа­ лось стойким и наследовалось. Адаптированные к более аэроб­ ным условиям дрожжи отличались от обычных большим содер­ жанием цитохрома и цитохромоксидазы. При блокировании, цитохромоксидазной системы развитие таких дрожжей в при­ сутствии кислорода оказалось невозможным.

48