книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

Было важно выяснить, является ли способность вызывать активное брожение на среде с более низкими значениями pH

свойством термофильного варианта или она возникла в резуль­ тате адаптации к повышенной кислотности среды. С этой целью были поставлены опыты брожения с термофильным

вариантом дрожжей, не адаптированным к повышенной кислот­ ности среды.

Брожение проводилось на обычном солодовом сусле — с величиной pH = 5,2—5,13 — и на солодовом сусле подкис­ ленном, с величиной pH — 3,7—3,5. Продолжительность брожения была та же — 72 часа.

В первом опыте этой серии испытывалась бродильная актив­ ность термофильного варианта при брожении обычного солодо­ вого сусла и подкисленного до значения pH = 3,7. Во втором опыте была взята также исходная (мезофильная) раса дрож­ жей и брожение с нею проводилось на обычном солодовом сус­

ле при температуре 28—30°. Брожение термофильного варианта

* Термофильный вариант Та — после длительного культивирования на солодовом сусле с обычной кислотностью (значение pH = 5,3)

Как видно из табл. 18 и рис. 13 (средние цифровые данные), термофильная культура дрожжей, не адаптированная к среде с повышенной кислотностью, обладает несколько сниженной бродильной способностью на солодовом сусле с низким значе-

109

нпем pH (3,7—3,5). Количество накопленного спирта в этик условиях снизилось, однако, всего на 4% по сравнению со спир­ том, накопленным при обычной величине pH солодового сус­

ла (5,2—5,13). Количество же клеток дрожжей к концу броже­

ния оказалось на 20 % меньшим по сравнению с брожением при величине pH среды, равным 5,2—5,13. Таким образом, несмот­

руется, влечет за собой ослабление его активности. Требуется определенный период времени, в течение которого клетки могут вновь приспособиться к измененным условиям существования.

Опыты по изучению влияния предварительного культивиро­ вания термофильных дрожжей при более низких значениях pH среды вскрыли важный в практическом отношении факт: если культура термофильных дрожжей предварительно адапти­ рована к условиям жизни в более кислой среде, то, будучи пере­

110

несена в условия с оптимальным значением pH, она заметно активней бродит. Таким путем может быть повышена бродиль­

личающихся повышенной кислотностью.

Более кислотовыносливые термофильные штаммы дрожжей

описаны, как мы уже сообщали, Кировой (1953 а). Они были выделены из ржаного теста и оказались способными развивать­ ся в очень широких границах величины pH = 2,5—7,0.

В этой связи представляют интерес исследования Фан Синь-

Фана и сотрудников (1956). Путем последовательного повыше­ ния температуры были успешно адаптированы две расы дрож­

жей — Sacch. formosensis и Sacch. ellipsoideus — к развитию

при 42°. При этом было обнаружено, что, наряду со значитель­

ным усилением их размножения и биохимической активности, у них расширились оптимальные границы pH их нормальной жизнедеятельности и оптимум реакции среды был сдвинут

вкислую сторону.

Внаших исследованиях также было показано, что при пас­ сировании термофильной культуры на естественной среде —

солодовом сусле с повышенной кислотностью — без труда можно селекционировать варианты дрожжей, способные хо­ рошо развиваться и обладающие высокой биохимической актив­ ностью при более низких значениях pH.

Таким образом, наши экспериментальные данные и данные литературы позволяют сделать общий вывод о большей приспо­ собленности термофилов к жизни в более широких пределах значений pH среды.)

Рост и размножение термофильных дрожжей при разных температурах культивирования

Отличительную черту группы термофильных микроорганиз­ мов составляет значительное ускорение у них всех физиологи­

ческих процессов при высокой температуре. На эту особен­ ность обращено внимание авторов многочисленных исследова­ ний, посвященных изучению широко распространенной в природе группы термофилов.

Ускоренный рост и развитие этих микроорганизмов при по­ вышенной температуре по сравнению с мезофильными сопрово­

ждаются более быстрым старением и отмиранием их клеток.

Эта закономерность была обнаружена у самых различных групп

бактерий и грибов.

Как правило, у мезофильных форм кривая роста постепен­ но повышается и, достигая своего максимума, так же плавно затем снижается.

111

Иная картина наблюдается при развитии термофилов. Кривая их роста бывает выражена резким подъемом до мак­ симума, затем так же резко она падает вниз, что свидетель­

ствует о быстром распаде и лизисе клеток.

В связи с таким ускоренным темпом размножения у многих термофильных организмов или не обнаруживается начальной стационарной фазы (лаг-фазы), или она бывает очень кратковре­ менной.

Скорость' размножения термофильных дрожжей на среде с мальтозой при высокой температуре

Как показало изучение свойств экспериментально получен­ ной термофильной формы дрожжей, при развитии ее в условиях повышенной температуры значительно ускоряются биохимиче­

ские процессы, например брожение. Однако в конце сбражива­

ния солодового сусла всегда обнаруживалось меньшее число

клеток, чем у мезофильной формы, развивающейся при обыч­ ной температуре (28—30°).

Многократные наблюдения подтвердили это положение. В табл. 19 представлены цифровые данные по размножению термофильного варианта Т2, длительно (в течение двух лет) культивируемого на солодовом сусле 7° Бал., с содержанием

* Средние данные по трем опытам.

Эти опыты показали, что число дрожжевых клеток у тер­

мофильных дрожжей после двухсуточного их культивирова­ ния вдвое меньше по сравнению с их числом у исходной куль­

туры при размножении ее в условиях обычной температуры —

но у исходной расы, развивающейся при высокой температуре.

112

На основании полученных данных нами было высказано

два предположения по поводу причины замедленного размноже­ ния клеток термофильных дрожжей.

Процесс почкования, связанный в первую очередь с аэроб­

ным дыханием клеток, мог сильнее угнетаться повышенной температурой, нежели процесс сбраживания углеводов, т. е. анаэробное дыхание. При таком положении за длительный пе­ риод адаптации активность функции почкования постепенно уменьшалась и как бы все больше и больше «отставала» от

активности функции брожения. При более длительном существо­

вании дрожжей в условиях повышенной температуры процесс почкования, в результате адаптации, будет проходить все бо­ лее и более интенсивно, как показали наши опыты.

Можно было также предполагать, что при адаптации дрож­ жей чрезмерная интенсификация деятельности энзиматическо­ го комплекса и всех процессов, связанных с обменом, сказыва­ ется на размножении. Это приводит к преждевременному ста­ рению и массовому отмиранию клеток к концу брожения. На ослабление клеток термофильных дрожжей в конце брожения указывало появление значительного числа окрашивающихся

метиленовой синью клеток.

С целью проверки первого предположения мы изучили ха­ рактер размножения у дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы,—

термофильного варианта и исходного штамма, которые в те­ чение восьми лет культивировались на солодовом сусле с вы­ соким содержанием сахара (14—15%). Термофильный вариант поддерживался постоянно при температуре 40°, исходный — при обычной температуре 28—30°.

Опыт ставился по обычной методике, на высококонцентри­ рованном солодовом сусле, в колбах Эрленмейера емкостью

рами Мейссля и ставились при соответствующих температурах.

Через 72 часа определялись накопленный спирт и остаточный сахар. Кроме того, производились наблюдения за состоянием клеток дрожжей и определялось их число путем счета в счет­ ной камере.

Все последующие опыты брожения ставились по этой мето­ дике.

В табл. 20 показана интенсивность размножения исходной (мезофильной) культуры и термофильного варианта Т3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что к концу бро­ жения при 40° клеток термофильных дрожжей накапливается меньше, чем клеток исходной культуры к концу брожения при

28—30°. Эти различия менее выражены у варианта Т3 при со­ поставлении активности его размножения с вариантом Т2.

Вариант Т2 культивировался при 40° более короткий срок (два года).

Следовательно, более длительный период культивирования

термофильных дрожжей при высокой температуре способ­

ствовал более полной их адаптации, в результате чего несколько ускорился процесс их почкования.

Не исключена возможность, что длительное культивирова­ ние дрожжей на среде с высоким содержанием сахара также оказало благоприятное влияние на процесс размножения бла­ годаря защитному действию сахара.

Оставался нерешенным вопрос, является ли замедленное размножение свойством экспериментально полученной расы дрожжей или же данная форма интенсивно развивается при высокой температуре, но быстрее стареет и гибнет? Поэтому

представляло особый интерес изучить размножение термофиль­

ных дрожжей в процессе их развития (по часам). Исследования были проведены с термофильной формой —

вариантом Т3.

В табл. 21 и на рис. 14, а, б1 показана динамика накопления клеток дрожжей в процессе культивирования в течение 72 ча­ сов на солодовом сусле с 14,44 % сахара при разных темпера-1

1 Рисунки 14, а, б даны по другому опыту из этой серии.

114

Рис. 14. Скорость размножения мезофильных и термофильных дрожжей на солодовом сусле с высоким содержанием сахара (14,44 г в 100 мл)

а! 1 — мезофильные дрожжи (температура опыта 28—30°); 2 — термофильные дрожжи

(температура опыта 39—40°); б: 1 — мезофильные дрожжи (температура опыта 39—

40°); 2 — термофильные дрожжи (температура опыта 39—40)’; в: 1 — мезофильные

дрожжи (температура опыта 28—30°); 2 — термофильные дрожжи (температура опыта

28—30 °)

После высева одного и того же количества культуральной

жидкости на чашки Петри с солодовым сусло-агаром количество

выросших колоний термофильных дрожжей было больше

(см. табл. 21).

116

При более длительном брожении (44 часа) число клеток в

контроле при температуре 28—30° несколько возрастает и достигает 40,75 млн. в 1 мл среды (рис. 14, 1а), в то время как у термофильной формы число клеток начинает уже снижаться

(36,6 млн. в 1 мл среды; рис. 14, 2а).

Таким образом, при температуре 40° максимальное число клеток, накопленных в среде у экспериментально полученной формы, примерно такое же, как в контроле, но скорость раз­ множения их значительно больше.

Исходная культура дрожжей, не адаптированная к повышен­ ной температуре 40°, размножается в этих условиях значитель­ но медленнее (примерно в три-четыре раза) по сравнению с

формой адаптированной — вариантом Т3 (рис. 14, б).

В аналогичных условиях роста у адаптированной формы процент мертвых клеток незначителен и не превышает 3,5,

у исходной он достигает 68.

Высев равного объема культуральной жидкости на чашки Петри с сусло-агаром также показал значительную разницу в числе образовавшихся колоний. Так, например, если у ис-

ходной формы выросло 39,5 колоний, то у термофильной на» много больше — до 215 колоний (табл. 21, опыт 2);

Различие было также и в весе накопленной биомассы у двух опытных рас дрожжей. Если после двухсуточного броже­

ния при 40° сухой вес клеток —0,2751 г, — накопленных исход­

ной расой, принять за 100%, то сухой вес клеток термофиль­ ной расы (0,4094 г) будет равен 148,8%.

Микроскопическая картина состояния клеток изучаемых форм дрожжей представлена на рис. 15, а, б.

На рис. 15, а показан внешний вид клеток исходной культу*

ры Sacch. cerevisiae XII расы после двухсуточного развития ее на высококонцентрированном солодовом сусле при темпера­ туре 39—40°.

Клетки полиморфные, у многих нарушена оболочка и содержимое вышло наружу. У части клеток протоплазма крупнозернистая, в ряде случаев она отошла от стенок, что

в хорошем состоянии.

Скорость размножения термофильных дрожжей

при температуре 30°

Установив основные закономерности размножения экспери­ ментально полученной при высокой температуре расы дрожжей,

мы приступили в дальнейшем к изучению ее физиологических особенностей при температуре более низкой (28—30°), опти-

117