книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

Эти различия касаются морфологических, физиологических и биохимических особенностей термофильного варианта дрож­

жей, полученного экспериментальным путем из Sacch. cerevi­ siae XII расы.

Термофильный вариант отличается от мезофильной культу­ ры по форме и величине клеток, а также по размерам гигант­ ских колоний. Клетки его более мелкие, округлой формы. Ха­ рактерна небольшая величина гигантских колоний.

Основным отличительным свойством термофильной культу­

ры является значительно большая устойчивость к воздействию

высокой температурой по сравнению с исходной (мезофильной)

расой и ускорение при этом основных физиологических процес­

сов, протекающих в клетке. Интенсифицируется образование спирта, увеличивается скорость размножения клеток.

Более ускоренный рост и развитие этой культуры при повы­

шенной температуре по сравнению с мезофильной сопровожда­

ются более быстрым старением и отмиранием клеток.

При брожении адаптированного к повышенной температу­ ре варианта дрожжей в условиях более низкой температуры

(28—30°) он дает одинаковый с обычными дрожжами или не­ сколько пониженный по сравнению с ними выход спирта, но

размножается в полтора-два раза быстрее и накапливает при этом большую биомассу. Если сухой вес дрожжей исходной культуры принять за 100%, то у экспериментально получен­ ной формы за тот же промежуток времени (72 часа) накапливает­ ся биомасса в количестве 120,72%. Это свойство адаптирован­ ные дрожжи сохраняют на протяжении многих лет.

Термофильный вариант отличается от исходной (мезофиль­

ной) культуры резко измененным типом основного обмена. У него в сильной степени снижена энергия аэробного дыхания как в условиях повышенной температуры (40°), так и при оптималь­ ной для мезофильной расы температуре (28—30°). Так, при рас­ чете на единицу сухого вещества, клетки мезофильной культу­

ры за 60 мин. поглощали 26,54 мм3 кислорода воздуха при температуре 30° и 37,6 мм3 при температуре 40°. Клетки же

термофильного варианта — только 11,07 мм3 при температуре 30° и 11,32 мм3 при температуре 40°. При температуре 30° аэробное дыхание у термофильного варианта было снижено на 140%,

при температуре 40° — почти на 240% (см. табл. 34). Эта раз­ ница была бы несколько меньше, если бы представилось воз­ можным использовать в опыте по дыханию обе культуры строго одного физиологического возраста: в данном случае были взяты

двухсуточные культуры — и мезофильная и термофильная. Последняя, развиваясь предварительно при температуре 40°,

т. е. при ускоренном темпе размножения, была по возрасту несколько старше.

149

Более слабое аэробное дыхание у термофильной культуры сопровождается значительным снижением активности цитохром­ оксидазной системы.

При сниженной энергии аэробного дыхания, у термофиль­ ного варианта дрожжей повышена функция брожения. Так,

при температуре 30° энергия брожения клеток термофильных дрожжей выше энергии брожения клеток мезофильных дрож­ жей на 9%, прп температуре 40° — на 20% (см. табл. 35).

Более, интенсивное анаэробное дыхание (брожение) у термо­ фильного варианта коррелирует с наличием у него более актив­ ного гидролитического фермента мальтазы. Так, при опреде­ ленных условиях опыта, этот препарат фермента, выделен­ ный из клеток термофильных дрожжей, мог быть на 42% активней мальтазы, выделенной из клеток мезофильной (исход­ ной) культуры (см. табл. 39).

Таким образом, адаптация нашего термофильного варианта дрожжей к повышенной температуре сопровождалась перестрой­

кой основного обмена клеток на бродильный тип: несколько повышенной оказалась функция брожения и резко сниженной— функция аэробного дыхания.

Одной из причин таких изменений в обмене следует считать изменение кислородного режима в среде и уменьшение его концентрации вследствие меньшей его растворимости в усло­ виях повышенной температуры.

Перестройка основного обмена на бродильный тип коррели­ рует с некоторыми цитологическими особенностями клеток термофильных дрожжей — например, увеличением, размеров

их ядер (см. рис. 11). Вскрытые нами изменения в основном об­ мене носят более глубокий характер и связаны с изменениями клеточного протопласта в целом.

Цитофизиологические изменения клеток дрожжей, наблю­

даемые в аэробных, или анаэробных условиях их существова­ ния, которые происходят постоянно при переходе от одних

(более аэробных) условий существования этих организмов к другим (более анаэробным), были описаны в 1938 г. Мейселем. Им же были предложены термины «бродильный» и «дыхательный» тип дрожжей (Мейсель, 1938, 1939, 1950). При изучении свойств

адаптированного к повышенной температуре варианта дрож­ жей на основании цитологических и физиологических измене­ ний его в соответствии с данными литературы, мы могли,

варианта! свидетельствует высокое соотношение между энергией брожения ((>со2) и энергией дыхания (<?о2)-

Определение степени анаэробиоза по соотношению между анаэробным и аэробным дыханием предложено Одинцовой. Чем

150

выше энергия брожения и чем ниже энергия дыхания, тем соотношение между этими величинами будет выше. Поэтому большее соотношение характеризует большую степень анаэро­ биоза (Одинцова, 1957).

При сопоставлении наших опытных культур дрожжей —

мезофильной расы и термофильного варианта Т3— соотноше­ ние между энергией брожения и энергией дыхания у первой

из них было равно 7,6 (при температуре 30°) и 3,2 (при темпе­ ратуре 40°). У второй при тех же условиях 19,82 и 24,95 (см.

табл. 34 и 35). Эти цифры также свидетельствуют о значитель­

ной перестройке клеток термофильного варианта на бродиль­

ный тип, наследственно закрепленной. Интересно, кроме того,

следующее: при температуре |40° степень анаэробиоза у термо­

фильного варианта еще выше, чем при температуре 30°. Она связана как с повышением энергии дыхания (см. табл. 34), так и с повышением энергии брожения (см. табл. 35). Однако

активность брожения повышена больше, чем активность ды­

хания, поэтому и соотношение между ними больше. Эти дан­ ные служат еще одним подтверждением в пользу того что при температуре 40° термофильный вариант больше приспособлен к жизни в анаэробных условиях за счет повышения основного обмена, особенно анаэробного дыхания (брожения). Исходный вариант, отличаясь относительно высоким аэробным дыханием (см. табл. 34), обладает слабой степенью анаэробиоза (см. табл.35), как это было отмечено. При более высокой температуре он не приспособлен к нормальному функционированию из-за того, что в этих условиях он требует большего количества кислорода

ду энергией брожения и энергией дыхания: 7,6 при 30° и 3,2 при 40° (см. табл. 35). Абсолютные величины энергии бро­ жения и дыхания у термофильных и мезофильных дрожжей при температуре 30 и 40° показаны на рис. 23. Они иллю­ стрируют цифровой материал табл. 34 и 35.

В исследованиях витаминного питания дрожжевых микро­ организмов и при изучении механизма действия витаминов на микробную клетку все больше и больше приводится доказа­ тельств в пользу существования более тесной взаимосвязи меж­ ду потребностями в готовых витаминах и биохимическими и физиологическими свойствами дрожжей. Так, Мейсель уста­

новил, что витамин Вх и биотин играют важную роль в пере­ стройке клеток на «бродильный» и дыхательный» тип (Мейсель, 1940, 1941, 1947, 1950). Доказана связь пара-ампнобензойной

кислоты с каротиноидными пигментами дрожжей (Мейсель, 1941, 1943; Медведева 1948, 1951). Известно, что дрожжи,

сбраживающие лактозу, нуждаются в никотиновой кислоте

151

(Rogosa, 1943, 1944). Специальное исследование по изучению закономерностей биологического синтеза витаминов во взаимо­ связи с бродильной функцией дрожжей было проведено Один-

цовой (1941, 1957, 1959).

Обследовав большую группу

[Sacch. rim (Meyen) Kudriavzev],

обладающие высокой бродиль­ ной энергией, Одинцова уста­

новила определенные корреля­ ции между потребностью в го­

товых витаминах и функцией

брожения. Среди представите­ лей вида Sacch. cerevisiae подав­ ляющее большинство форм ока­ залось полностью не способным к синтезу пантотеновой кисло­ ты. У вида Sacch. carlsbergensis

основным витамином, который часто эта группа организмов бывает совершенно не способна синтезировать, является пири­ доксин (витамин Б6). Синтез пантотеновой кислоты осущест­ вляется, наоборот, в большей степени.

т. е. меныпей потребностью в кислороде воздуха. Энергия брожения при этом несколько выше, чем у представителей вида Sacch. cerevisiae. Таким об­

разом, культуры вида Sacch. carlsbergensis отличаются более

анаэробным типом обмена, который связан с часто наблюдае­ мым явлением резкой неспособности к синтезу витамина Вв.

Полученные данные по сравнительной характеристике ос-

152

новного обмена и потребностей в готовых витаминах у наших экспериментальных культур дрожжей — мезофильной и тер­ мофильного варианта Т3 — позволяют провести сопоставление с наблюдениями, сделанными Одинцовой.

Наш термофильный вариант отличается от исходной мезо­ фильной культуры не только по внешнему виду клеток, но и из­

менениями в типе основного обмена. Он более приспособлен к жизнедеятельности в условиях недостатка кислорода возду­ ха благодаря резко сниженной энергии дыхания и меньшей,

следовательно, потребности в свободном кислороде воздуха.

При этом функция брожения у него повышена, что компенси­ рует замедленное аэробное дыхание. По своему более анаэроб­ ному типу обмена термофильный вариант Тз более близок к

виду Sacch. carlsbergensis, нежели к виду Sacch. cerevisiae. В со­

поставлении с исходной (мезофильной) культурой более анаэ­

робный тип обмена его связан с резко выраженной недоста­ точностью в синтезе витамина Вв и, наоборот, с большей приспо­

собленностью к синтезу пантотеновой кислоты. Такого рода способность к синтезу витаминов характерна для представи­ телей вида Sacch. carlsbergensis.

Таким образом, резкая утрата способности к синтезу вита­ мина В6 служит еще одним доказательством в пользу того, что адаптированный термофильный вариант дрожжей представляет

собою форму, резко отличающуюся от исходной типом основ­ ного обмена. Эти изменения касаются глубокой перестройки протопласта клеток и определяют более анаэробный тип орга­ низма. Изменения носят наследственный характер.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ ДРОЖЖЕЙ

Применение термофильных дрожжей для сбраживания крахмалистых заторов

В летнее время, вследствие повышенной температуры воз­

духа и недостаточно низкой температуры воды, на спиртовых заводах нередко наблюдается повышение температуры бро­ жения до 35—37°. Оптимальной же температурой для дея­ тельности дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы, применяемой

при производстве спирта, являются 28—30°. Брожение при повышенной температуре проходит ненормально, сахар полно­ стью не сбраживается, что приводит к большим потерям в вы­ ходе спирта.

Одним из способов улучшения работы таких заводов может стать применение дрожжей, способных производить полное сбраживание углеводов при температуре 37—39°. С этой целью мы испытали полученную нами экспериментальную термофиль-

153

ную расу дрожжей, которая нормально сбраживала сахар со­

лодового сусла 16° Бал. при температуре 39—40°.

Испытание этой культуры дрожжей в производстве, при

сбраживании крахмалистых заторов, представляло большой практический интерес.

В укрупненно лабораторных опытах брожение термофиль­ ных дрожжей проводилось на заторах, осахаренных как ячмен­ ным солодом, так и культурами плесневых грибов. По поводу

использования плесневых грибов имеются интересные указа­ ния Пена и соавт. (Pan, Andreasen a. Kolachov, 1950): при сбраживании зернового затора, осахаренного грибом Asper­ gillus niger, были получены лучшие показатели по выходу спир­ та и скорости брожения в тех случаях, когда температура

дображивания была не 30°, как обычно, а несколько выше — 37°. Нами в качестве заменителей зернового солода применя­ лись поверхностные и глубинные культуры плесневых грибов

Asp. oryzae, Asp. niger и Rhizopus delemar.

Фенпксова (1953) особенно подчеркивает тот факт, что два указанные вида аспергиллов резко различаются друг от друга по способности их к образованию амилазы и мальтазы, но и тот и другой обеспечивают полный гидролиз крахмала. Отли­ чительной особенностью Asp. niger является его пониженная амилолитическая активность (в 20—25 раз меньшая, чем у

Asp. oryzae). Однако активность фермента, гидролизующего

мальтозу, у него повышена.

Как показали Керр с соавторами (Kerr, Cleveland a. Ratzbeck, 1951), в культуре Asp. niger образуется особый фермент,

названный авторами амилоглюкозидазой, которая расщепляет как высокополимерные углеводы (амилазу и амилопектин), так и дисахарид мальтозу, вследствие чего этот фермент иногда

называют мальтазой (Schwimmer, 1945; French a. Knapp, 1950).

Аналогичный фермент, названный глюкамилазой, был вы­ делен Филлипсом и Колдуэллом (Phillips a. Caldwell, 1951)

из культуры гриба Rhizopus delemar. Оба эти фермента в ка­ честве конечного продукта гидролиза давали главным образом глюкозу, а не мальтозу, что является характерным для систе­ мы солодовых амилаз, а также для а-амилазы Asp. oryzae.

Сбраживание ржаных заторов, осахаренных ячменным солодом

Эти опыты проводились в лабораторных условиях, в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл. Ржаные заторы, осахаренные ячменным солодом, охлаждались до температуры 30°, после

чего вносились посевные дрожжи в виде водной суспензии. Предварительное размножение дрожжей проводилось на соло-

154

довом сусле 16° Бал. В опыт бралась двухсуточная культура. Начальное число клеток дрожжей в заторе было 4—6 млн. в 1 мл среды. Колбы закрывались затворами Мейссля и стави­

лись на брожение при температуре 28—30° (исходная, мезо­

фильная культура) и при температуре 40° (термофильный вари­ ант Т3). Брожение длилось трое суток. По окончании брожения в фильтрате были определены: отброд по Баллпнгу, кислот­ ность по Дельбрюку, накопленный спирт, редуцирующие веще­ ства (сахар) до и после гидролиза, а также число клеток дрожжей.

Таблица 42

Сбраживание ржаных заторов, осахаренных ячменным солодом (средние данные по 4 параллельным сосудам)

Анализ бражки

Количество

несброженного сахара, %

Дрожжи

Результаты опытов приведены в табл. 42. Брожение про шло с одинаковым выходом спирта как в контрольных, так и опытных заторах.

Сбраживание заторов, осахаренных грибом

Aspergillus oryzae

При сбраживании заторов, осахаренных культурой гриба Asp. oryzae при высокой температуре (38—39°), проявилось рез­ кое различие в показателях брожения: во всех без исключения случаях термофильные дрожжи дали худшие результаты (табл. 43) как по количеству конечного продукта брожения — сппр= та,— так и по количеству несброженного сахара.

Многолетняя практика работы в заводских условиях пока­ зала, что дрожжи прекрасно размножаются на заторах, осаха­ ренных культурой этого гриба, так как в них, благодаря вы­ сокой активности протеолитических ферментов (Полянская, 1955), образуется значительно больше аминокислот по сравне­ нию с солодовыми заторами. Плохие результаты брожения,

с термофильными дрожжами следует отнести, несомненно, за

155

Таблица 43

Сбраживание ржаного затора, осахаренного культурой гриба

Опыт № 3

Поверхностная культура, раз­

Опыт № 4

Глубинная культу­

счет отрицательного влияния повышенной температуры на ами­ лазу гриба. Большая чувствительность амилазы Asp. oryzae к температуре отмечалась многими. Это обстоятельство и учи­ тывается в практике работы заводов с культурой данного орга­ низма в качестве заменителя солода (Фениксова и Шилова,

1953).

Сбраживание заторов, осахаренных грибом

Aspergillus niger

При осахаривании заторов культурой гриба Asp. niger при температуре 38—39° не наблюдалось больших различий в ре­ зультатах брожения между обычными и термофильными дрож­ жами: по количеству конечного продукта брожения (спирта)

и по количеству несброженного сахара термофильные дрожжи

дали лучшие результаты. Полное осахаривание крахмала и

156

Таблица 44

Сбраживание ржаных заторов, осахаренных культурой гриба Aspergillus niger

Понижение содержания спирта в этих опытах объясняется более низкой концентрацией сахара в заторе.