книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

жается в «фенотипической задержке» (т. е. в пребывании мута­ ций в скрытом состоянии). Стали указывать, что мутации мо­ гут произойти у большинства особей в популяции и что мута­

ции, создающие резистентность к какому-либо яду, могут выз­ ваться этим же самым ядом, а следовательно иметь направлен­ ный характер».

Биохимический механизм

Адаптация микроорганизмов к тем или иным условиям сре­ ды осуществляется при помощи различных механизмов.

Под воздействием внешнего фактора функции клеток мик­ робов могут усиливаться или ослабляться. Это один из наи­ более простых и часто встречающихся механизмов адаптации.

Сюда могут быть отнесены примеры приучения микроорганиз­

мов к использованию различных сахаров, к синтезу витаминов

ит. д.

Вэтом отношении особый интерес представляют исследо­

вания Кудрявцева, Косикова, Шпигельмана и некоторых дру­ гих по приспособлению микроорганизмов к ассимиляции раз­ нообразных сахаров: мальтозы, сахарозы, галактозы, араби­

нозы.

Экспериментально была показана не только возможность адаптации дрожжей к усвоению различных углеводов, но в

ряде случаев удалось частично вскрыть и механизм, при по­ мощи которого дрожжи приобрели такую способность.

Положительные результаты в этом направлении могут быть

достигнуты при использовании следующего приема: в среду,

где содержится вещество, не усваиваемое микробом, добав­

ляется небольшое количество другого вещества из близкой

ему группы, легко усваиваемое клетками. Затем от пассажа к пассажу постепенно уменьшают дозу второго вещества и тем самым приучают организм ассимилировать то вещество, ко­

торое ранее ему было недоступно.

Таким путем Кудрявцевым (1938) были приучены дрожжи Sacch. paradoxus к усвоению мальтозы. Полученный новый вариант дрожжей Sacch. paradoxus был способен усваивать мальтозу после того, как полностью использовались ассими­

лируемые сахара (глюкоза, фруктоза и сахароза).

Приспособление дрожжей Sacch. globosus к усвоению и сбра­

живанию сахарозы в опытах Косикова (1954) проходило ус­ пешно, когда культура пересевалась на среду с сахарозой и глюкозой. В результате были получены формы, способные сбраживать сахарозу. Во всех тех случаях, где добавление легко усваиваемого сахара вызывало последующее приспособ­ ление организма к ассимиляции другого, родственного ему,

50

ранее недоступного сахара, усвояемый сахар, как можно

предположить, был необходим для начала роста и нормального

развития культуры. Когда же запас усвояемого сахара, вно­ симого обычно в небольшом количестве, приходил к концу, то к тому времени организм был уже в состоянии вырабатывать фермент или комплекс ферментов и тем самым ассимилировать неусвояемый до того сахар. Возможно также, что роль этого

легко доступного вещества не ограничивается использованием его только в качестве необходимого источника питания. Уча­ ствуя в общем обмене веществ, оно может способствовать обра­

зованию предшественника и самого фермента, необходимого для расщепления и, следовательно, использования недоступ­ ного субстрата.

Исследованиями Шпигельмана (Spiegelman, 1945) было установлено, что в процессе приспособления дрожжей к сбражи­

ванию галактозы образуется по крайней мере два фермента. Один из них осуществляет функцию фосфорилирования галак­ тозы, другой участвует в изомеризации фосфорилированных про­ дуктов в промежуточные при последующем брожении глюкозы.

По мнению Гардена и Норриса (Harden a. Norris, 1910),

роль фосфатов в сбраживании галактозы сходна с ролью их

в сбраживании глюкозы. Наблюдаемый более длительный лаг-

период авторы объясняют относительно медленным накопле­ нием фосфорных эфиров. Аналогичные высказывания мы на­ ходим у Ингрема (1955).

В других случаях для того, чтобы усилить способность к син­ тезу того или иного вещества, требуется постепенно умень­ шать концентрацию его в питательной среде.

Так, например, клетки различных микроорганизмов могут усиливать или приобретать способность к синтезу ростовых

веществ — витаминов, аминокислот (микроаминокислот) — при недостатке или отсутствии этих веществ в среде. Много­ численные факты такого типа приспособления описаны Вудом, Андерсеном и Беркманом (Wood, Andersen a. Werkman, 1938), Сильверманом и Беркманом (Silverman a. Werkman, 1939), Леониеном и Лилли (Leonian a. Lilli, 1942), Козером и Райтом (Koser a. Wright, 1943), Линдегреном и Роутом (Lindegren а. Rout, 1947) и многими другими.

К числу наиболее сложных механизмов приспособления от­ носится такое изменение обмена, когда воздействующий фак­ тор подавляет или блокирует какой-то определенный фермен­ тативный процесс или систему ферментов и вследствие этого

происходит замена новыми ферментами или системами. Дру­ гими словами: одно звено обмена заменяется другим.

Подобный механизм обнаружен при адаптации микробов к различным антибиотическим веществам, ядам.

4*

51

E. coli, штамма, адаптированного к стрептомицину, было от­ мечено Умбрейтом (Umbreit, 1949). Адаптированный им штамм отличался от исходного изменениями в типе основного обмена: гликолиз (анаэробное дыхание) отсутствовал. Процесс аэроб­

пути углеводного обмена (Wiggert a. Werkman, 1939). При этом штамм, резистентный к солям фтористого натрия, утра­ чивал способность к дальнейшему превращению фосфоглице­ риновой кислоты. Вследствие этого в среде, содержащей глю­ козу, наблюдалось накопление фосфоглицериновой кислоты.

Как установили Норд и Мулл (Nord a. Mull, 1945), штамм, устойчивый к фтористому натрию, может не иметь фосфоглицеромутазы или энолазы, или обоих названных ферментов. По­ этому он и оказывается не способным производить дальнейшее

превращение фосфоглицериновой кислоты. Однако штамм усваивает глюкозу; это говорит о наличии какого-то другого способа расщепления углеводов. Таким образом, процесс адап­ тации микробов к фтористому натрию может вызвать подав­ ление одного пути в углеводном обмене и привести к усилению другого.

В некоторых случаях в ответ на воздействие определенными химическими веществами организм приобретает способность вырабатывать фермент, расщепляющий это вещество (Pollock,

живали ядовитое действие пенициллина.

Аналогичный механизм резистентности был обнаружен при адаптации гриба Endomyces vernalis к ппритпамину (Woolley,

1944). В результате адаптации был получен новый вариант,

переносящий большие концентрации этого вещества. Гриб приобрел новую способность вырабатывать фермент, разла­ гающий молекулу пиритиамина.

Иногда для обезвреживания действующих на клетку ядо­

витых веществ микроорганизмы приобретают способность свя­ зывать их и таким образом устранять их вредное влияние.

Такой механизм был установлен при адаптации дрожжей к повышенным концентрациям моногалогенных кислот. Меха­

низм, обусловливающий устойчивость дрожжей к этому веще­ ству, заключается в том, что глютатион, соединяясь с монога-

53

Понижение чувствительности бактерий в процессе адапта­

ции к химическим веществам сопровождается повышением

содержания липидов на поверхности бактериальных клеток

(Chaplin, 1952).

Известны примеры, когда устойчивость микроба к дейст­ вующему фактору приобретается в результате усиления спо­ собности к синтезу ростовых веществ. Так, например, устой­ чивость определенных штаммов бактерий к сульфонамидам объясняется тем, что у организма приобретается способность к более высокому синтезу р-аминобензойной кислоты (Landy, Larkum, Oswald a. Streightoff, 1943; Spink, Ferris a. Vivino, 1944).

Такая устойчивость к сульфонамидам, однако, не у всех организмов может быть объяснена увеличением синтеза р- аминобензойной кислоты. Из числа обследованных Ленди,

Ларкумом, Освальдом и Страйгтоффом патогенных бактерий

Escherichia coli, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae и Diplococcus pneumoniae не способны к более высокому синтезу р-амино-

бензойной кислоты по сравнению с исходными формами. Сле­ довательно, другой механизм обеспечивает им устойчивость к этому веществу.

В некоторых примерах адаптации микроорганизмов меха­

низм этого процесса еще не выявлен полностью, но отмечены

заметные изменения в проницаемости оболочки клеток. Это,

по-видимому, является ответной реакцией организма на повы­ шение осмотического давления во внешней среде, вызванного высокими концентрациями солей, сахара, а также повышенной температурой.

Имеются указания (Мишустин и Мессинева, 1933), что с переходом из более влажных мест в более засушливые, а также с севера на юг осмотическое давление в клетках микробов по­ вышается. Этот признак является стойким, передающимся при

размножении.

Примером адаптации дрожжей к высокому осмотическому

давлению является работа Токада (Tokada, 1953). Этот исследо­ ватель, путем постепенного пассирования дрожжей Saccharomyces ellipsoideus на средах, содержащих повышенные концентра­ ции Nad и КС1, получил культуры дрожжей, развивающиеся в присутствии высоких концентраций этих солей (NaCI — 8%,

КС1 — 10%). Они были весьма устойчивы к действию плазмо­ лизирующих веществ (NaCI, КС1, СаС12, глицерину, мочевине). В этих же условиях опыта исходная культура подвергалась резкому плазмолизу. Дрожжи, адаптированные к высокому

осмотическому давлению, сохраняли это свойство после пас­ сажа их на среде с низким осмотическим давлением. По-види­ мому, механизм адаптации был связан с изменением проницае­ мости клеток.

54

Таким образом, защитные механизмы, обусловливающие ре­ зистентность вариантов, бывают различными.

Цитируемые в этом разделе работы расширяют наши пред­

ставления о механизме действия различных веществ на микроб­ ную клетку. Вскрытие подобных механизмов позволяет на­

правленно и закономерно получать формы, полезные для прак­ тики.

В области сравнительного изучения путей обмена у исход­ ных и адаптированных к новым факторам среды форм микро­ организмов имеются значительные достижения. Это дает воз­ можность ближе подойти к расшифровке некоторых биологи­

ческих закономерностей.

В последние годы в литературе появляются высказывания о возможном переходе ненаследуемых изменений в наслед­ ственные. Так, например, некоторые исследователи приходят к выводу, что изменения, возникшие в культуре при индуцирован­ ном синтезе ферментов, также могут иметь наследственный ха­ рактер.

Наиболее простым случаем модифицированной (ненаследуе-

мой) изменчивости является способность организма усиливать синтез определенных ферментов под влиянием специфического

субстрата. Подробные сведения по данному вопросу можно найти в обзорных статьях Станиера (Stanier, 1951), Моно и Кона

(Monod et Cohn, 1952).

Наглядной иллюстрацией к высказанным положениям яв­

ляется работа Коен-Базира и Жоли (Cohen-Bazire et Jolit,

1952). Они применили метод попеременного выращивания

Е. coli на средах, содержащих в качестве единственного источ­

ника углерода глюкозу или лактозу. В процессе культивиро­ вания эти среды быстро менялись. Таким путем была получена культура, способная к синтезу фермента Р-галактозидазы при

отсутствии лактозы. Это свойство у данного штамма было на­ следственно закрепленным.

Интересные исследования по приучению ацетонобутпловых

бактерий Clostridium acetobutilicum к повышенным концентра­

циям бутанола проведены Н. Д. Иерусалимским (1957а) и

Г. В. Пинаевой (1957). Процесс адаптации продолжался 200

дней. В результате такого культивирования была получена новая форма, которая переносила более чем 2,5% бутанола. Предельная концентрация этого вещества для исходной куль­ туры была 0,8%.

Приобретенное свойство повышенной резистентности к бу­ тиловому спирту вначале не передавалось через споры. При дальнейшем же культивировании Cl. acetobutilicum на средах с бутанолом эта способность закреплялась и сохранялась у клеток, выросших из спор на среде без бутанола.

55

Наследственную передачу способности переносить более высокие концентрации бутанола авторы объясняют тем, что

образующиеся при длительном упражнении клеток адаптив­ ные энзимы п, возможно, более отдаленные энзиматические

системы закрепляются наследственно.

Взгляды о возможном стирании резкой грани между при­ родой наследственных и ненаследуемых изменений представ­ ляют большой интерес.

Поллок (Pollock, 1953, стр. 260) по этому поводу пишет: «Если мы теперь предположим, что все ферментные системы в клетке являются «адаптивными» и что основным специфиче­ ским фактором, необходимым для их образования, является сам субстрат-индуктор, то мы сможем построить схему наслед­ ственности п эволюции, основывающуюся на биологической взаимосвязи между ферментом и субстратом».

По предположению Поллока, в клетке существует одна об­

щая система, которая осуществляет синтез белков. Она обла­

дает сравнительно малой специфичностью. Окончательная же структура ферментного аппарата клетки, придающая ему спе­

цифичность, определяется природой индукторов. Он пишет (там же, стр. 267): «Подобные предположения неизбежно под­

водят нас к мысли о возможности получения направленных наследственных изменений под влиянием внешних факторов».

Предшественник с малой специфичностью должен существо­ вать в клетке, как считает Поллок, еще до прибавления индук­ тора (специфического субстрата). Он должен состоять из сое­ динений, аналогичных тем, из которых образуются строитель­

ные белки клетки, а также осуществляется синтез специфиче­ ских ферментов. Значительно проще, по его мнению, пути образования активного фермента из специфического предшествен­ ника.

Близкая по своему содержанию гипотеза была высказана также Хпншельвудом (1946, 1952), а затем Колдуэллом и Хпн-

шельвудом (Caldwell a. Hinshelwood, 1950).

Хпншельвуд и Колдуэлл концентрируют свое внимание на структурном механизме синтеза белка и взаимосвязях этого синтеза с нуклеиновыми кислотами и другими предшественни­ ками белков. Сущность представления Хиншельвуда и Кол­ дуэлла четко сформулирована в следующем изложении Опарина

(1957, стр. 263):

«В настоящее время в научной литературе широко распро­ странено мнение, что молекула нуклеиновой кислоты с ее спе­ цифическим взаиморасположением пуриновых и пиримидино­ вых мононуклеотидов в полинуклеиновой цепи является как бы матрицей, на которой осуществляется синтез того или иного

белка.

56

Каждая точка этой матрицы имеет специфическое сродство» к определенной аминокислоте. В результате этого, согласно представлениям Колдуэлла и Хиншельвуда, аминокислоты как бы кристаллизуются на молекуле нуклеиновой кислоты в строго определенном порядке, соответствующем структуре мат­ рицы».

О. Гоффман-Остенгоф расширяет представления о механиз­ ме образования ферментов. Он придерживается того взгляда, что путь образования индуцированных ферментов может стать одним из возможных путей образования любых ферментов клетки. По этому поводу он пишет (1957, стр. 131): «Сейчас принимается, что явлению индукции ферментов принадлежит значительно большая биологическая роль (особенно при про­

цессах дифференциации), чем это считалось раньше. Мы во всяком случае считаем себя вправе предположить аналогич­ ный механизм как возможный путь для первоначального обра­ зования исходных ферментов».

Пути синтеза адаптивных ферментов, химическая природа их предшественников являются в настоящее время темой ши­ рокой дискуссии и экспериментальных поисков.

На основании накопленных фактов высказываются пред­ положения, что этими промежуточными звеньями в цепи обра­ зования ферментов могут быть аминокислоты и полипептиды

(Pollock a. Wainwright, 1948; Jebb, Knox a. Tomlinson, 1950; Billen a. Lichstein, 1951; Steinberg a. Anfinsen, 1952; Halvor­ son a. Spiegelman, 1952; Шпигельман, 1957).

УСЛОВИЯ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ АДАПТАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микробные клетки по-разному реагируют на внешние воз­ действия. Известно, например, что способность приспособле­ ния к одному и тому же фактору различна не только у разных видов микробов, но даже у разных штаммов одного и того же

вида. Этот вопрос достаточно подробно освещен в литературе (Дюбо, 1948; Стефенсон, 1951; Краспльнпков, 1949, 1958;

Веркман и Вильсон, 1954).

Таково же отношение микроорганизмов и к действию высо­ кой температуры (Staiger u. Glaubitz, 1930; Киров и Лещин­ ская, 1937; Имшенецкий и Логинова, 1944; Bassett a. Slatter, 1953; Anellis, Lubas a. Rayman, 1954; Фениксова, Логинова и Шилова, 1956).

Так как различные штаммы одной и той же расы с различ­ ной скоростью приучаются к повышенной температуре, то целесообразно проводить исследования параллельно с несколь­ кими культурами, выделенными из одной клетки. На это

57

обстоятельство обращено внимание в работе Имшенецкого и Ло­

гиновой (1944).

Фихтер (Fiechter, 1954) изучал интенсивность дыхания и аэробного брожения у двух культур винных дрожжей при различных температурах брожения (5, 10 и 25°). Энергия бро­ жения у семисуточной культуры Sacch. ellipsoideus расы Stein­

Интенсивность дыхания семисуточной культуры также была значительно ниже по сравнению с энергией дыхания молодой од­

носуточной культуры и составляла соответственно 9, 8 и 3%.

Аналогичные результаты дали опыты с применением другой исследуемой расы дрожжей.

В настоящее время для более успешного получения под воз­ действием различных факторов изменчивых форм используют методику, которая позволяет осуществлять синхронизацию клеточного деления. Это дает возможность привести культуру в однородное состояние.

Наиболее часто описываются случаи, когда синхронное деление у микроорганизмов вызывается кратковременными, но резкими изменениями температуры. Синхронизацию клеточ­ ного деления, вызванную прерывистой обработкой теплом и охлаждением, наблюдали в своих опытах многие: Шербаум и Цейтен (Scherbaum a. Zeuthen, 1954, 1955), Цейтен и Шербаум (1954), Готчкпсс (Hotchkiss, 1954), Ларк и Маалое (Lark а. Maaloe, 1954), Хэнтер-Цибальская и др. (Hunter-Szybalska, Szybalski a. DeLamater, 1956).

Возраст клеток, их физиологическое состояние и отдель­ ные стадии их развития характеризуют биологические особен­ ности культуры микроорганизма.

За последнее время в литературе появились интересные сооб­ щения о действии неблагоприятных внешних факторов: более

чувствительными к ним оказались адаптивные ферменты в тот период, когда происходит их образование в клетках. Значи­ тельно более устойчивы эти же ферментные системы, когда их образование закончено (Pollock, 1945, 1953).

Генетические особенности организма, число клеток во вне­ сенном посевном материале, химический состав среды, степень

ее аэрации, температура культивирования, а также ряд дру­ гих факторов оказывают существенное влияние на процесс адаптации микробов к новым условиям существования.

У микроорганизмов в их жизненном цикле преобладает гаплоидная фаза. Вследствие этого они могут реагировать на изменение внешних условий быстрее, чем это возможно у дип­ лоидных форм (Stanier, 1953).

58