книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

Особенности клеточных структур также способствуют

резистентности термофильных микроорганизмов к высокой

■температуре.

Только вся совокупность перечисленных особенностей кле­

ток термофилов обусловливает возможность существования их при высокой температуре. Такого взгляда придерживается большинство исследователей. Однако значение отдельных отли­ чительных свойств и качеств расценивается по-разному.

Аллен (1953) высказала, например, предположение о том, что термофилам для восполнения инактивирующихся высокой температурой ферментов необходим ускоренный синтез самих ферментов или их предшественников. В правильности этой точки зрения, по мнению Аллен, убеждает отсутствие суще­ ственных различий в ферментном комплексе у термофилов и мезофилов. Не отличаются также заметно и конечные продукты

их метаболизма.

Подтверждением развиваемых Аллен взглядов служат и

данные Гаугрена (1949). Он не находил существенных разли­ чий между дыхательными системами у стенотермофильных ■организмов и мезофильных.

Значительный интерес представляет работа Гейнметса,

Тейлора и Лемана (Heinmets, Taylor a. Lehman, 1954). В их опытах суспензия Escherichia coli подвергалась сильному тем­

пературному воздействию. После этого бактерии были поме­

щены в обычную питательную среду для выявления жизнеспо­ собных клеток. Однако клетки, подвергнутые воздействию тем­ пературным шоком, могли размножаться лишь в том случае,

если к питательной среде добавлялись метаболиты три карбо­

ксильного цикла.

Хенкокк (Hancock, 1957) изучил оптимальные условия

синтеза протеинов термофильными спороносными бактериями при повышенной температуре. В работе была использована методика меченых атомов. Показано, что оптимальная темпе­ ратура синтеза протеинов соответствует оптимальной темпера­ туре размножения клеток — 55°.

Оптимальная температура для синтеза протеинов мезофиль­ ными культурами значительно ниже (Вагнер и Митчелл, 1958).

Многие термофильные микроорганизмы способны к синтезу биокаталитических веществ — витаминов и микроампнокислот. Они хорошо развиваются на синтетических минеральных средах. Однако большинство нуждается в получении этих ве­ ществ в готовом виде, будучи не способно к их синтезу.

Таким образом, не только специфические особенности са­ мой организации и свойств клеток термофилов, но и среда имеют немаловажное значение в осуществлении нормальной

жизнедеятельности их при повышенной температуре. Имше-

29

нецкий и Солнцева (1945а, б), Иерусалимский и Неронова

(1945) отмечают более высокую потребность в источниках азота,

витаминах и ростовых веществах термофильных маслянокис­ лых бактерий, выделенных из термофильного метантанка, в.

сравнении с мезофильными формами.

Подобного рода указания имеются и в зарубежной литера­

туре (Gaughran, 1949; Cleverdon, Pelczar a. Doetsch, 1949; Campbell a. Williams, 1953a,b и др.). Гаугрен находит, что

для развития стенотермофилов при высокой температуре (выше

38°) требуется большее количество кислорода, углекислоты и

других самых разнообразных питательных веществ.

Добавление к среде витамина К повышает термостабиль­ ность и выживаемость спор (Verona, 1955).

Бейкер, Хэтнер и Соботка (Baker, Hutner a. Sobotka, 1955)

подобрали синтетическую питательную среду, на которой хоро­ шо росли многие термофильные формы. Однако некоторые из них, развиваясь при более высокой температуре, требовали в готовом виде дополнительных веществ типа витаминов. Зак. например, они хорошо росли на основной среде при 75°, но с повышением температуры до 80° нуждались в добавлении к этой питательной среде метионина, лейцина и фенилаланина.

Логинова (1956), изучая свойства адаптированного к повы­ шенной температуре (40°) варианта дрожжей Saccharomyces cerevisiae (XII раса), обнаружила высокую потребность этой культуры в витамине Вв. Как известно, этот витамин содер­ жится в качестве активной группировки в ферментах, осуще­ ствляющих биосинтез аминокислот. Не исключена возмож­

ность, что термофилы, длительно культивируемые на полно­ ценных средах, в условиях сниженного содержания кисло­ рода воздуха утрачивают способность к синтезу этого-

витамина.

Повышенное содержание в среде сахаров, азотистых ве­ ществ, нейтральных солей, а также витаминов оказывает за­ щитное действие и предохраняет микробов от теплового инактивирования (Nakamura, 1897; Magoon, 1926 a, b; Angerer и.

Kuster, 1939; Anderson, Esselen a. Fellers, 1949; Erikson, 1952;

Amaha, 1952 a, b; Amaha a. Sakaguchi, 1951, 1952,1954; Bhat a.

Bilimoria, 1955).

Аналогичные данные имеются в отношении устойчивости

спор термофилов к нагреванию. Состав и концентрация пита­ тельных веществ среды имеют решающее значение для устой­ чивости спор к повышенной температуре (Anderson, Esselen a. Fellers, 1949; Reynolds a. Lichstenstein, 1950; Sugiyama, 1951; Pauchenne, 1954).

За последнее время в литературе появилось много данных, которые указывают на особое строение протеинов термофиль-

30

Наличие у большинства термофилов процесса спорообразо­ вания также составляет их специфическую особенность: как известно, споры более устойчивы к высокой температуре, чем

вегетативные клетки. Однако Ингрем (Ingram, 1955), сопостав­ ляя свойства бактериальных спор и свойства спор у дрожжей, обращает внимание на крайне малую термоустойчивость по­ следних в сопоставлении их с вегетативными клетками. Воз­

можно по этой причине дрожжи в подавляющем своем боль­ шинстве и принадлежат к группе термотолерантных микроор­ ганизмов.

Многие термофильные бактерии отличаются от мезофилов содержанием большего числа жгутиков. По-видимому, при помо­ щи этого механизма они способны быстрее передвигаться и тем самым скорее получать питательные вещества из среды.

К цитологическим особенностям следует отнести наличие большого числа гранул в протоплазме термофилов. Они, надо полагать, также связаны с более ускоренной ферментативной

деятельностью клеток.

Несмотря на обнаружение специфических для термофилов морфолого-цитологических особенностей их клеток, подобные

изменения обнаруживаются в ряде случаев и у мезофильных

форм при их жизнедеятельности в условиях повышенных тем­ ператур.

Ламанна (1940) изучал морфологические особенности 105 культур различных видов мезофильных бактерий при разных температурах их размножения. При низкой — минимальной для роста — температуре величина бактериальных клеток была наибольшей, а при высокой — максимальной температуре — наименьшей.

Таким образом, меньший размер клеток является свойством,

присущим не только термофильной группе микроорганизмов,

но и мезофильным формам, развивающимся в зонах макси­ мальных температур. Уменьшение величины бактериальных клеток у культур, развивающихся при повышенных темпера­

турах, не всегда, однако, наблюдалось. Об этом пишутГаугрен

(1947), Христоферсен и Прехт (1950), Шугар и др. (Shugar, Jarmolinska a. Feltinowski, 1955).

Основное же отличие термофильных форм от мезофильных заключается в наследственной закрепленности их свойств. Так, например, Логиновой (1948) удалось наблюдать сохранение малой величины клеток у термофильных дрожжей Saccharomyces cerevisiae даже после многих пассажей этой культуры при 30°.

Некоторые гипотезы, высказанные ранее об особых при­

способлениях у термофильных организмов, направленных на защиту против действия высокой температуры, в настоящее время не подтвердились и представляют лишь исторический

32

интерес. К числу таких гипотез следует отнести гипотезу Ро­ бертсона (1927), Хемпила (1932) и некоторых других о суще­

ствовании у термофилов защитной капсулы или мембраны. В более поздних исследованиях с использованием электрон­

ного микроскопа наличие защитных капсул в клетках микро­

бов, культивируемых при высоких температурах, не нашло под­

тверждения (Gaughran, 1947а; Shugar, Jarmolinska a. Feltinowski, 1955).

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Термофильные микроорганизмы произошли в результате адаптации мезофилов к повышенной температуре. Такого взгля­ да придерживаются многие, в их числе Рабинович (Rabinowitsch, 1895), Шиллингер (Schi(linger, 1898), Циклинская (1898,

1899, 1903), Имшенецкий (1944), Мишустин (1950), Билимория

и Бхат (1954).

Имеется и другое мнение. Лиске (Lieske, 1921), Клёйвер и Бааре (Kluyver a. Baars, 1932), Аллен (1953) рассматривают

возникновение термофильных форм мутационным путем из мезофильных микроорганизмов. При этом новые свойства воз­ никают спонтанно, независимо от внешней среды.

Существует также точка зрения о первичном возникнове­

нии термофильных микроорганизмов, и они рассматриваются как наиболее древние микробные формы. Появление их отно­

сится к тому периоду, когда на земле существовала высокая температура. В ходе дальнейшей эволюции из них образова­ лись мезофильные формы. В настоящее время такого рода ги­ потезу развивают Клегг и Джейкобс (1953).

Мишустин (1950) не исключает возможности сохранения некоторых термофильных микроорганизмов на Земле в каче­ стве реликтовых форм. Они возникли на земной поверхности и сохранились с того времени, когда температура Земли была более высокой. Ранее эту точку зрения высказывали Уид (Weed, 1889), Амброж (Ambroz, 1913), С. М. Голикова (1926). Они

Гаугрен (1947а) и другие полагают, что термофильные микро­ организмы распространены главным образом в географических зонах с жарким климатом, откуда они заносятся в страны с умеренной температурой.

Вряд ли такое положение может быть безоговорочно при­ нято, если учесть наблюдение, сделанное Мишустиным и Ва­ сильевой (1945). Как ими было установлено, почвы южных районов Советского Союза не являются благоприятной средой для развития термофилов вследствие ограниченного содержа-

ния в них влаги. Пока не доказана также и ранее высказанная

ратуры.

Многочисленные' исследования, проведенные по экспери­ ментальному получению термофильных форм из мезофилов,

дают возможность утверждать, что их возникновение в природе происходило посредством адаптации к изменяющимся темпера­

турным условиям среды.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГА НИЗМОВ

Термофильные микроорганизмы способны существовать при высоких температурах. Эта адаптация проходила не толь­ ко в направлении приспособления к температурному фактору,

но п к измененным физико-химическим условиям среды, в ча­ стности к пониженному содержанию кислорода. Раствори­

мость его в жидкой среде при высокой температуре, как извест­ но, значительно снижается.

С теоретической точки зрения возможность получения в ла­ бораторных условиях термофильных микроорганизмов из

довольно ограничено. В большинстве из них был использован метод культивирования мезофильных микроорганизмов при постепенно повышаемых температурах.

Деллинджеру (Dallinger, 1887) удалось путем постепенного повышения температуры в течение семи лет приучить инфузо­ рии развиваться при 70°. Первоначально они культивировались при оптимальной температуре 21°. Эти изменения носили на­

следственный характер.

Иоллос (Jollos, 1921) пытался приучить Paramecium саиdatum к жизни при более высоких температурах, значительно больше тех, которые они обычно переносят. Им были полу­ чены положительные результаты при использовании метода постепенного повышения температуры.

Аналогичного типа данные сообщены Жабуневич (Szabuniewic, 1929), Г. Ф. Гаузе (1939) и др.

Возможность адаптации микроорганизмов к высокой тем­ пературе была впервые показана Пастером (Pasteur, 1881).

Культивируя спороносную палочку сибирской язвы при 42— 43°, ему удалось довольно быстро получить новые аспоро­

34

наследственный характер. Термофильный вариант можно адап­

тировать и к более высокой температуре —44°, однако физио­

логическая активность при этой температуре значительно ослаблена.

При использовании аналогичной методики Ф. Г. Сарухаиян и А. Т. Севоян (1955) удалось получить термоустойчивые расы хлебопекарных дрожжей. Экспериментально полученная тер­ мофильная форма энергично развивалась при 40° и обладала большей ферментативной активностью и скоростью размноже­ ния по сравнению с исходной расой. С некоторыми теоретиче­

скими выводами авторов согласиться все же нельзя. По поводу закрепления новых свойств Саруханян и Севоян пишут: «Для

закрепления термостойких признаков нужно вести планомер­

ное культивирование в средах при возрастающих температу­ рах» (1955, стр. 15). В указанных условиях происходит измене­ ние свойств культуры. Закрепление же новых свойств у полу­ ченных вариантов может быть достигнуто лишь в результате длительных пассажей измененной культуры в новых, но стан­ дартных условиях среды.

Большой интерес представляют исследования Фан Синь-

Фана и сотрудников (Fang, Tang, Tsai a. Wu, 1956), которым посредством постепенного повышения температуры удалось адаптировать дрожжи Sacch. formosensis и Sacch. ellipsoideus к 42°. Сбраживание при температуре 40° этими термофиль­ ными вариантами сопровождалось образованием значительно большего количества спирта, чем исходными формами при 30°;

при этом энергия брожения и аэробного дыхания у адаптиро­ ванных форм оказалась выше.

Плесневые грибы также могут быть легко адаптированы к

высокой температуре, и максимум их размножения иногда до­ стигает 55—63°. Однако оптимум развития в большинстве слу­ чаев не превышает 40° (Мишустин, 1950).

Процесс адаптации микроорганизмов к высоким темпера­ турам протекает довольно длительно, и клетки сравнительно медленно приспосабливаются к новым условиям существования. Это свидетельствует о значительном консерватизме наслед­ ственности, проявляемом микробами по отношению к темпера­

турному фактору.

В большинстве случаев адаптация к повышенной темпера­ туре сопровождается также глубокими наследственными измене­ ниями свойств микробов. Известны, например, многие формы

термофилов, которые в результате развития при высоких тем­

пературах (50—60°) утратили способность расти при более низ­ ких температурах. В ряде случаев была показана возможность

и обратного перехода термофильных микробов в мезофильные формы, но эта реверсия проходила с большим трудом.

36

Из сероземных почв Средней Азии Мишустиной (1950

были выделены культуры с температурным оптимумом разви тин 37—39°. Только после девятилетнего пребывания в лабо

раторной обстановке при температуре 26—28° наблюдалось снижение оптимальных и максимальных пределов развития.

Таким образом, температурные границы развития термофиль­

ных микроорганизмов и их изменения, особенно у стенотермо­ фильных форм, являются признаком, передающимся по нас­

ледству. 1 ермофильные варианты, полученные в лабораторных условиях, также способны сохранять новые свойства. В боль­

шинстве случаев они наследственно закрепляются.

Известны случаи адаптации микроорганизмов, когда посте­ пенному воздействию повышенными дозами нового фактора под­ вергались споры.

В данной серии работ следует отметить исследования Ма-

гуна (Magoon, 1926 а, Ь). Ему удалось повысить устойчивость спор Вас. mycoides к высокой температуре. Вначале споры вы­ держивали нагревание при 100° в течение 2 мин. В результате многократных воздействий постепенно повышаемой темпера­ турой были получены терморезистентные варианты; споры их выдерживали нагревание при 100° в течение 50 мин.

1 ерморезистентные споры получены по этой методике Биджелоу и Ести (Bigelow a. Esty, 1920), Девисом и Вильямсом

(Davis a. Williams, 1948).

Метод так называемой трансформации или наведения свойств в настоящее время особенно широко используется для полу­ чения форм микробов с желаемыми свойствами. Сущность

этого приема заключается в том, что один штамм микроба куль­

тивируется на фильтратах или на очищенных препаратах дезок­ сирибонуклеиновой кислоты, полученной из клеток другого штамма. Заким путем представляется возможным определен­ ные свойства, характерные для одного штамма, передать дру­ гому, который этой способностью не обладал. Во многих слу­ чаях возникшие новые свойства у микробов закрепляются на­ следственно (см. обзоры литературы Тимакова и Скавронской,

1956 а, б; Логиновой, 1957).

Метод «наведения свойств», несомненно, перспективен: поль­

зуясь им, удается за сравнительно непродолжительный срок получить наследственно измененные формы с желаемыми свой­ ствами. В этом направлении известны работы Л. А. Зильбера (1928), Н. А. Красильникова (1941, 1945), Н. П. Грачевой (1946), Г. П. Калины (1952), К.В.Косикова (1954), В. Д. Тимако­ ва и Н. С. Семчевой (1956), Д. Г. Кудлай (1956а,б), А. А.Имшенец-

кого, К. 3. Перовой, Г. А. Зайцевой и А. Н. Белозерского (1958). «Наведением свойств» широко пользуются за рубежом, и в этом направлении достигнуты интересные результаты: был осу­

37

ществлен перевод авирулентных форм в вирулентные, полу­

чены формы, устойчивые к различным ядовитым веществам,

антибиотикам, и т. п.

Прево и Тувено (Prevot et Thouvenot, 1952) методом тран­ сформации повысили термоустойчивость некоторых анаэроб­ ных форм бактерий. Для исследований была взята культура

Clostridium valerianicum. Споры этого штамма выдерживали

нагревание лишь в течение 10 мин. при 100°. Второй штамм —

Cl. var. strasbourgensis — отличался более высокой термоустой­

чивостью; споры его выдерживали нагревание при 100° в те­ чение 4 часов.

Из второй культуры был приготовлен фильтрат, а также получен очищенный препарат.

В первой серии опытов культивирование Cl. valerianicum проводилось на фильтратах из-под второй культуры в течение 2,5 и 4 час. После контакта в течение 2,5 час. термоустойчи­ вость чувствительного штамма повысилась в четыре раза. По­ сле контакта в течение 4 час.— в семь раз.

Аналогичные результаты были получены во второй серии

опытов, где культивирование проводилось на очищенных пре­ паратах. Способностью к трансформации, как было указано,

обладали не все испытанные штаммы Cl. valerianicum.

В более ранних исследованиях испытывались другие анаэроб­ ные культуры (Prevot, Raynaud et lataki, 1951).

Для получения ценных для использования в практике форм микробов пользуются также лучистой энергией.

При сильном воздействии различного рода лучистой энер­ гией удается нарушить нормальный обмен веществ и в боль­ шинстве случаев получать формы с пониженной жизнеспособ­ ностью, но со свойствами, часто полезными для практики.

Так, известны мутанты грибов, дрожжей и бактерий, образую­ щие более активную амилазу, протеиназу, способные к повы­ шенному синтезу витаминов, антибиотиков, мутанты с различ­

ными температурными пределами жизнедеятельности и т. и.

При воздействии ультрафиолетовыми лучами на гриб Лх- pergillus nidulans Броцкой (1956) удалось получить варианты со значительно измененными свойствами. Одной из характер­ ных особенностей была повышенная активность протеолитиче­ ских ферментов. По сравнению с исходными формами эти ва­

рианты намного медленнее развивались.

Широко применяются в промышленности варианты плесне­ вых грибов из рода Penicillium, полученные в результате облу­ чения исходных культур. Они обладают способностью образо­ вывать значительное количество пенициллина. При облучении исходных штаммов получены также так называемые биохими­

ческие мутанты с нарушенным синтезом тех или иных амино­

•38