46. Соотношение полов и проблема регуляции пола у сельскохозяйственных животных

Соотношение полов — отношение числа самцов к числу самок в раздельнополой популяции.

Соотношение полов наряду с половым диморфизмом является важной характеристикой раздельнополой популяции. Обычно его выражают количеством самцов, приходящихся на 100 самок, долей мужских особей или в процентах. В зависимости от стадии онтогенеза различают первичное, вторичное и третичное соотношение полов. Первичное — это соотношение полов в зиготах после оплодотворения; вторичное — соотношение полов при рождении и, наконец, третичное — соотношение полов зрелых, способных размножаться особей популяции.

Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению селекционно-племенной работы. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому, осаждением, центрифугированием в градиенте плотности, электрофорезом, обработкой специфическими антителами и т.д. (1-3). Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах для сортировки спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на неодинаковом содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что в Х-хромосоме млекопитающих оно выше, чем в Y-хромосоме (7), в частности у быков — на 3,8, у хряков — на 3,6, у баранов — на 4,2, у жеребцов — на 3,7 % (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). Разбавленную сперму, к которой добавлен флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342, инкубируют при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия для ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение индуцирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, несущих Х- или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапли, куда попадает по одной половой клетке. В зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в такой клетке Х- или Y-хромосомы, каждая микрокапля приобретает положительный или отрицательный заряд. Микрокапли с поврежденными или неидентифицированными сперматозоидами заряда не несут. В современных установках формируется 70-80 тыс. микрокапель в секунду (12). На следующем этапе образовавшиеся положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы разделяются, проходя через электростатическое поле, и поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды концентрируют центрифугированием и разбавляют специальной средой (13-15).

Разработанная технология предусматривала использование стандартной системы с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения составляла 350 тыс. сперматозоидов в час (10). Позднее, когда описанную технологию усовершенствовали, в том числе за счет повышения давления в системе до 4,22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования по улучшению ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y- хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только при условии, что в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (около 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).

В процессе разделения с помощью высокоскоростной проточной  цитометрии сперматозоиды подвергаются действию неблагоприятных факторов (окрашивание, высокая степень разбавления семени, лазерное излучение, давление, электромагнитное поле, центрифугирование) (17-19), поэтому важна разработка условий, обеспечивающих сохранение биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения помещают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется при центрифугировании половых клеток сразу после сортировки и добавлении глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y-фракции применяют полимеразную цепную реакцию (22), а также метод флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой (в дозе содержалось 5 млн клеток). Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в варианте с осеменением Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 — самцами. Низкие результаты оплодотворяемости отмечали и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли здоровое потомство.

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой — 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов и 74 % самок при оплодотворении соответственно Y- и Х-фракцией (20).

Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами in vitro (26). С помощью проточной цитометрии выделяли фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х- и до 70 % — с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй — 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % особей мужского пола (27).

На коровах также изучали эффективность пересадки эмбрионов, полученных in vitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16,3, с синхронизированным — 20,0, у телок — 34,2 %. Из 40 родившихся особей 37 были телочками.

В более поздних исследованиях оценили эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных in vitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40,9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, — 41,9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96,8 % были самками.

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, изучалась возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Дозу неразделенной спермы, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов, вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах оплодотворяемость оказалась довольно высокой. Затем для осеменения использовали разделенную фракцию незамороженной спермы со 100-200 тыс. сперматозоидов в дозе. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. незамороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой неразделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42, в контроле — 54 %. В опытной группе получили 80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу  криоконсервированной спермой (1,0; 1,5 или 3,0 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам из опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой неразделенных половых клеток. В опыте и контроле доля отелившихся телок равнялась соответственно 29,6 и 55,6 %, коров — 21,9 и 23,4 %. При этом в опытных группах родилось 85,3 % самок, в контрольных — 58,6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2,2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно 37,7; 42,2 и 39,6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). В период спонтанной охоты 157 животным из опытной группы вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, а 149 из контрольной — 15 млн неразделенных. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочно криоконсервированной разделенной спермы, полученной от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, проявились достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы сперматозоидами из фракции, содержащей Х-хромосому, достигала 47 %, телок джерсейской породы — 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Установлен факт более высокой доли мертворождений среди телят мужского пола при осеменении сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным при оплодотворении коров соответственно разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий по изучаемым показателям между двумя группами животных не установили. При использовании неразделенной спермы получили 49,2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов — 87,8 % самок, Y-содержащей фракции — 92,1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не нарушает структуру ДНК в клетках (41). За рубежом коммерческое использование разделенной по полу спермы началось в 2000 году, и к настоящему времени этим способом в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков применяют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и выживаемость заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало выживаемость и оплодотворяющую способность незамороженных половых клеток (44).

Основная трудность при применении разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что число сперматозоидов в дозе должно быть больше, чем при осеменении крупного рогатого скота. Первых поросят от разделенного семени получили после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки оплодотворяли in vitro c использованием фракции Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. Также удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных незамороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и их дальнейшей активации in vitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0,3; 0,5 и 1,0 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При 2-кратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с показателем в контрольной группе, осемененной неразделенной спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные in vitro с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были выполнены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой изучалась в специальных опытах (57). Овцам из опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным — 50 млн неразделенных. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61,5; 66,1 и 66,7 %; в контроле — 63,2 %.

У кобыл при инъекции разделенной незамороженной спермы в верхушку рога матки получили 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, гистероскопическое введение половых клеток в верхушку рога матки — более перспективный способ осеменения (59, 60). Оплодотворяемость удавалось повысить, если 20 млн сперматозоидов помещали в маточно-трубное сочленение (61). Этим способом также получали потомство, применяя криоконсервированную разделенную сперму жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет собой эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения.