16. Реакции иммунитета: механизм, ингредиенты, практическое применение, способы постановки. Реакции нейтрализации токсина антитоксинами; реакция преципитации, реакция агглютинации; рнга; рск

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела), соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ). Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента расщепляется и среда окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1. Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2. Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антигенантитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином основана на способности антитоксических антител связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических антител их смесь вводят лабораторным животным.

При диагностике некоторых инфекционных заболеваний, возбудители которых продуцируют экзотоксины, используют реакцию нейтрализации токсина антитоксином. Для ее проведения исследуемый материал, в котором подозревают наличие токсина, смешивают с соответствующей антитоксической сывороткой и после инкубации в термостате вводят лабораторным животным (белые мыши, морские свинки). Контрольным животным вводят только исследуемый материал. Если взятая в опыт антитоксическая сыворотка нейтрализует токсин, животные останутся живы. Контрольные животные гибнут под действием токсина. Реакция нейтрализации используется для выявления токсинов возбудителей ботулизма, столбняка, газовой гангрены.Часто для определения активности иммунных антитоксических сывороток анатоксинов используется реакция нейтрализации по механизму флоккуляции.

Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Компоненты реакции преципитации.

1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.

+2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;

б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации.

Примером РП в геле является реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

+Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации

Реакция агглютинации (РА) - это иммунная реакция взаимодействия антигена с антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с адсорбированными антигенами). При агглютинации происходит склеивание корпускулярных антигенов антителами, что проявляется образованием хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что антитела имеют два активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации возбудителя, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в сыворотке крови больного антител к возбудителю (например, реакции Райта и Хеддлсона при бруцеллезе, реакция Видаля при брюшном тифе и паратифах).

Самый простой способ постановки РА - реакция на стекле, это ориентировочная РА, которая применяется для определения возбудителя, выделенного от больного. При постановке реакции на предметное стекло наносят диагностическую агглютинирующую сыворотку (в разведении 1:10 или 1:20), затем вносят культуру от больного. Реакция положительная, если в капле появляется хлопьевидный осадок. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. Если диагностическая агглютинирующая сыворотка неадсорбированная¹, то ее разводят (до титра - разведения, до которого должна происходить агглютинация), т.е. ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающимися

¹ Неадсорбированная агглютинирующая сыворотка может агглютинировать родственные бактерии, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

РСК: Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система. Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система. РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК. 1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым). 2. Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации). 3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции. 4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана. 5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная). 6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК. Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56С в течение 30 мин. РСК проводят в 2 фазы. I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин. II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин. Учет результатов РСК проводят при безупречных результатах в контролях. Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь". В диагностике инфекционных заболеваний также используются реакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома. Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества. Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью. Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях. Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными   антителами   разной   групповой   специфичности.  Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.