SRCWFBHKn8
.pdfКроме того, характерная «универсальная» фиолетовая флуоресценция приписывается окисленным органическим соединениям, содержащим карбонильные группы (Теренин, 1974; Карякин, Грибовская, 1987; Синельников, Хмылев, 1987). Таким образом, за вторую полосу может быть ответственна группа фенольных соединений, именуемая первичным гумусом.
Регистрация спектра возбуждения на длине волны 508 нм выявила один максимум поглощения – 376 нм, что подтверждает высказанное ранее утверждение о гуминовой природе флуоресценции в области 494–508 нм. Действительно, согласно многим данным литературы, гуминовые вещества интенсивно поглощают свет в именно области 370–400 нм (Люцарев, 1968; Синельников, 1970; Генералова, 1974; Апонасенко и др., 1997; Ершова, Копелевич, 1999; Харламова, Новиков, 2002).
Были проведены некоторые дополнительные исследования по выяснению химической природы соединений, вызывающих флуоресценцию. В частности, проводили экстракцию РОВ хлороформом или четыреххлористым углеродом (Синельников, 1970). После экстракции, даже в чистых водах, не содержащих нефтепродукты, наблюдали уменьшение интенсивности первого пика свечения на 12–44% (в культуральных средах – на 35–39%). Однако экстракт в исследованном спектральном диапазоне не флуоресцировал. Более того, проведенный с экстрактом анализ ИК-спект- ров поглощения в области 2 500–25 000 нм (4 000–400 см-1) обнаружил присутствие в нем соединений типа простейших карбоновых кислот (муравьиной, уксусной), но не ароматических веществ (см. Приложения). Второй пик флуоресценции в результате экстракции практически оставался без изменений или его интенсивность даже возрастала. Это может свидетельствовать в пользу тушения веществами первой группы соединений свечения второй группы. Известно, что гуминовые вещества не экстрагируются хлороформом и подобными неполярными растворителями (Унифицированные методы.., 1973). С другой стороны, есть указания на то, что ароматические аминокислоты и пептон снижают флуоресценцию фульвокислот, хотя сами по себе тоже флуоресцируют (Синельников, 1970). Очевидно, извлекаемые хлороформом соединения, обуславливающие УФфлуоресценцию первой полосы, являются веществами не гуминовой природы. Вследствие плохой растворимости в неполярных растворителях они не полностью извлекаются из водной среды, сосредотачиваются преимущественно на границе раздела фаз и поэтому в экстракт практически не попадают. Предположительно, это и есть циклические аминокислоты, пептиды и частично разрушенные белки.
С целью проверки правильности сделанных выше предположений были проведены исследования флуоресцентных характеристик чистых препаратов тирозина и триптофана, а также o-оксибензойной кислоты, или салициловой кислоты (все вещества марки ч.д.а.). Известно, что м-окси- бензойная кислота рекомендована в качестве образца сравнения для флуо-
70
ресцентного метода определения гумусовых кислот в морских водах (Методические основы.., 1988). Упомянутая методика – единственная обнаруженная нами стандартизированная методика флуоресцентного определения гуминовых веществ.
При возбуждении светом 266 нм водные растворы тирозина и триптофана обнаружили флуоресценцию в виде сплошных спектров с максимумами 302 и 352 нм соответственно (рис. 19), что вполне согласуется с данными литературы (Баренбойм и др., 1966; Артюхов, Путинцева, 1996). Отмечено, что интенсивность свечения триптофана была примерно вдвое больше, чем у тирозина. Спектр o-оксибензойной (салициловой) кислоты также представлял собой сплошную полосу с максимумом 408 нм (рис. 19).
Рис. 19. Спектры флуоресценции исследованных органических кислот, отн. ед.
По градуировочным рабочим растворам в диапазоне концентраций от 0,031 до 2,000 мг/л (серия последовательных двукратных разведений) были построены калибровочные графики количественного определения тирозина и триптофана (рис. 20, 21). На их основании можно сделать вывод о том, что порог минимальных надежно обнаруживаемых в водных растворах флуоресцентным методом количеств тирозина на параметрах регистрации спектров («St») составляет порядка 0,06 мг/л и триптофана – 0,03 мг/л (pH около 7–8). Для исследования возможных эффектов взаимодействия обсуждаемых аминокислот в случае их одновременного присутствия в воде регистрировали флуоресценцию раствора, содержащего тирозин и триптофан в концентрациях 0,5 мг/л каждого (рис. 22). На основании
71
приведенного спектра можно сделать вывод об отсутствии заметного взаимного влияния тирозина и триптофана на флуоресценцию друг друга. Единственным эффектом было некоторое снижение (на 2,2 и 10,7%) интенсивности флуоресценции обоих веществ по сравнению с индивидуальными растворами, а также распространение полосы свечения триптофана на полосу тирозина, что привело к частичному ее поглощению и отсутствию четкого пика тирозина на общем спектре.
При попытке смоделировать ситуацию совместного присутствия обсуждаемых соединений в природных водах, исследовали раствор, содержащий смесь тирозина, триптофана и оксибензойной кислоты в концентрациях 1,0; 0,5 и 1,0 мг/л соответственно. Была получена трехвершинная широкая полоса флуоресценции с указанными выше максимумами, присущими индивидуальным соединениям (рис. 22). Однако, в отличие от первой смеси, данный раствор показал значительные отличия в интенсивности свечения испытуемых соединений в нем по отношению к чистым веществам. Например, все соединения давали в смеси бóльшие показатели уровня свечения, чем в индивидуальных растворах: тирозин на 7,1%, триптофан на 17,2%, салициловая кислота на 56,3%. Кроме того, произошло смещение максимума салициловой кислоты в более коротковолновую область: с 408 нм до 392 нм. Указанные явления, очевидно, связаны с сильным перекрыванием полос свечения триптофана и салициловой кислоты.
На основании приведенных результатов можно заключить, что совместное присутствие аминокислот тирозина и триптофана в растворе может формировать одну полосу свечения, положение максимума которой будет зависеть от концентрации преобладающего соединения. Чувствительности используемого нами спектрофотометра вполне достаточно для определения присутствия указанных аминокислот. Так, по данным В.С. Злобина (1976), содержание аминокислоты тирозина в РОВ из проб воды Фаре- ро-Шетландского канала составляло 0,28 0,06 мг/л, в водах Норвежского моря оно колебалось в разные годы от 0,05 до 0,13 мг/л. Триптофан присутствовал в морских водах в меньшем количестве от 0,04 до 0,07 мг/л в Норвежском море. Преобладание содержания тирозина над триптофаном является для РОВ характерным признаком, по крайней мере, в морских водах (Злобин, 1976). Следует помнить, что присутствие аминокислот в свободном виде или в составе пептидов в океанских водах значительно меньше, чем в пресных и тем более в культуральных средах, содержащих высокие биомассы фотосинтезирующих гидробионтов. С другой стороны – максимумы свечения аминокислот в составе белков и пептидов незначительно отличаются по своему положения от таковых у чистых веществ (Злобин, 1976). Что касается o-оксибензойной кислоты, то она действительно может служить образцом для сравнения, но только для веществ первичного гумуса, а не гумусовых кислот, как это предлагается в известной методике (Методические основы.., 1988).
72
Рис. 20. Калибровочный график определения содержания тирозина в воде флуоресцентным методом.
Рис. 21. Калибровочный график определения содержания триптофана в воде флуоресцентным методом.
73
Рис. 22. Спектры флуоресценции смесей органических кислот, отн. ед.
Разница между этими группами веществ скорее всего существенна, особенно если учитывать, что так называемый первичный гумус – подвижная компонента водной среды: он может выделяться и поглощаться обратно гидробионтами за достаточно короткие промежутки времени. Ниже мы еще вернемся к обсуждению этого вопроса.
4.4. Токсикологические опыты на водорослях и элодее
Данные по токсическому действию хрома (VI) в различных концентрациях на спектры флуоресценции РОВ в присутствии зеленых водорослей представлены на рис. 23, 24 (см. также рис. 9). Простое сравнение спектров флуоресценции контроля и опыта показывает, что их отличия касаются лишь левой половины спектров. Токсический эффект более заметен в проявлениях динамики содержания соединений, флуоресцирующих в области 300–340 нм (рис. 10). В меньшей степени интоксикация затрагивает динамику содержания веществ, условно относимых к первичному гумусу (рис. 12). Для хлореллы наиболее существенные отличия между опытом и контролем, зарегистрированы на 6-е сутки экспозиции. Далее просматривается фазность в реагировании культуры. Задержка метаболической активности водорослей на шестые сутки опыта к 18–20 суткам приводит к резкому ее всплеску. Суммарные показатели флуоресценции – уровень пи-
74
ков, площадь под спектрами – в этот период значительно превышают контрольные значения. В характере спектров следует отметить смещение позиции коротковолнового пика: в опыте с 0,1 мг/л вправо до 340 нм и в контроле влево до 300 нм, что свидетельствует об изменениях в составе экзометаболитов водорослей при интоксикации. По мере выхода культуры на стационарную фазу роста отличия между опытом и контролем постепенно уменьшаются и к 49–56 суткам становятся малозаметными. Однако обращает на себя внимание резкий рост уровня коротковолновой компоненты спектра, очевидно, связанный с массовым отмиранием и лизисом клеток культуры. Динамика спектров флуоресценции среды при концентрации хрома 0,01 мг/л занимала промежуточное положение между приведенными выше результатами.
Для лучшей иллюстрации токсического действия был построен график концентрационной зависимости по результатам другого эксперимента с хлореллой за 10 суток экспозиции (прибор регистрации «Флуорат»). Здесь для лучшей иллюстрации токсического эффекта взята динамика одной полосы регистрации – 314 нм (рис. 25). Как видно из рисунка, в контроле проявляется фазность динамики уровня свечения. При концентрации 1,0 мгCr/л фазность исчезает, и наблюдается поступательный процесс – такая картина интоксикации водорослей обычно характерна для стрессовых состояний (Новиков, 1992).
Рис. 23. Динамика спектров флуоресценции среды при развитии культуры водоросли Chlorella в условиях интоксикации (0,01 мгСг/л), отн.ед.
75
Рис. 24. Динамика спектров флуоресценции среды при развитии культуры водоросли Chlorella в условиях интоксикации (0,1 мгСг/л), отн. ед.
Рис. 25. Динамика уровня полосы флуоресценции 314 нм среды Успенского с хлореллой при разных условиях интоксикации хромом, отн. ед. (сглаженная).
76
В остальных концентрациях фазность сохраняется, но при концентрации 5,0 мгCr/л хорошо заметно снижение интенсивности флуоресценции, т.е. происходит угнетение выделительной функции.
Общая динамика уровня свечения всех полос флуоресценции также может быть показательна, особенно при действии низких концентраций, т.к. позволяет получить представление о специфике токсического эффекта на уровне воздействия близкого к пороговому. Как видно из рисунков 26 и 27 (см. также рис. 14), колебания всех кривых обладают значительной синхронностью, что свидетельствует о единой природе нарушений, происходящих при интоксикации в динамике метаболизма обеих фракций флуоресцирующих соединений. Действие токсиканта, очевидно, выражается в задержке лаг-фазы развития культуры по сравнении с контролем по крайней мере до 5-х суток. Напомним, что для выхода водорослей на последующую логарифмическую фазу роста свойственен короткий период обратного поглощения экзометаболитов из среды и снижение, таким образом, их концентрации, а значит и уровня свечения. После таких задержек следует сильное увеличение выделения экзометаболитов, возможно пассивно связанное с взрывным нарастанием численности клеток в культуре, сопровождающееся соответствующим возрастанием площади выделяющей экскреты поверхности.
Рис. 26. Динамика уровня свечения полос флуоресценции среды при развитии Chlorella в условиях интоксикации хромом (0,01 мг/л), отн. ед.
77
Рис. 27. Динамика уровня свечения полос флуоресценции среды при развитии Chlorella в условиях интоксикации хромом (0,1 мг/л), отн. ед.
Задержка деления клеток в опыте, вытекающая из сравнения динамик уровня свечения на рис. 14, 26 и 27 убедительно свидетельствует о токсическом эффекте на водоросли уже при концентрации хрома 0,01 мг/л. В целом этот процесс носил обратимый характер, так как сменился стимуляцией выделения по сравнению с контролем. Однако, как для любого физиологического процесса, в перспективных исследованиях возможна разработка токсикологических критериев, определяющих связь ранних нарушений выделительной функции клеток водорослей с более отдаленной общей патологией.
Несколько иная картина наблюдается в случае с элодеей: резкая стимуляция первой полосы флуоресценции с максимумом около 324–328 нм, свидетельствующая о повышении концентрации метаболитов, при действии максимальной концентрации бихромата калия (1 мгCr/л) приходится на 3-и сутки экспозиции (рис. 28). Далее в опыте до 18-х суток происходит снижение этого показателя, в то время как в контроле он продолжает плавно нарастать. Затем, на 28-е сутки, снова происходит рост максимума флуоресценции в концентрации хрома 1 мг/л, одновременно в контроле он также достигает наибольшего значения (см. рис. 15, 16). На последнем этапе эксперимента уровень флуоресценции поступательно снижается, причем в контроле быстрее, чем в опыте с концентрацией 1 мгCr/л.
78
Рис. 28. Динамика спектров флуоресценции среды Успенского при развитии элодеи (1 мгСг/л), отн. ед.
Вторая полоса флуоресценции в обоих описанных случаях проявляется в незначительной степени только во второй половине эксперимента. Сколько-нибудь заметных отличий между опытом и контролем при этом не наблюдается. Особая картина отмечена при действии концентрации хрома 0,1 мг/л (рис. 29). Характер изменения первой полосы флуоресценции почти полностью совпадает с контролем, но всегда превышает его по уровню флуоресценции (стимуляция). На 42–48-е сутки четко проявляется двухвершинная вторая полоса флуоресценции с максимумом в области 388 нм. Поскольку до этого полоса флуоресценции с таким максимумом нами не регистрировалась, мы исследовали ее спектр возбуждения. Спектр возбуждения флуоресценции на длине волны регистрации 388 нм охарактеризовался наличием двух примерно равных по величине излучения максимумов: 242 нм и 290 нм. Очевидно, что подобные параметры спектра возбуждения сближают данную полосу флуоресценции с первой коротковолновой, а не второй, связанной с веществами первичного гумуса (см. раздел 4.3). Таким образом, при интоксикация хромом в концентрации 0,1 мг/л произошло отделение от первой группы флуоресцирующих соединений (циклические аминокислоты) дополнительной фракции, отличающейся, прежде всего, как мы полагаем, бóльшим молекулярным весом. Аналогичное явление уже упомянуто нами в конце раздела 4.1. при рассмотрении спектров флуоресценции Phaeodactylum.
79