SRCWFBHKn8

ны, соответствующую максимуму на спектре флуоресценции. Затем диспергирующий элемент монохроматора сканировали в определенном интервале длин волн и записывали изменение интенсивности флуоресценции, которое и представляло ее спектр возбуждения. Спектры возбуждения регистрировали на длинах волн максимумов флуоресценции в диапазоне экситации (возбуждающего излучения) 220–350 нм. Шаг сканирования спектров возбуждения составлял 2 нм (скорость развертки 25 нм/мин).

При регистрации спектров применяли две стандартные позиции установок на спектрофлуориметре «FP-550», отличающиеся размерами ширины спектральных полос (щелей) возбуждающего и излучаемого света. Постоянные параметры прибора были следующими: временная постоянная «Time constant» – время срабатывания усилителя флуоресцентного излучения 1 с, селектор «Selector» – напряжение, прикладываемое к фотоэлектронному умножителю 1, чувствительность «Sensitivity» 1 – 1/10, переменная чувствительность «Variable» 5, режим считывания «Read mode» 5 с. Для регистрации спектров флуоресценции устанавливали размеры щелей: экситации – 10 нм, эмиссии – 10 нм (позиция измерений, условно названная как «St»). Для регистрации спектров возбуждения (иногда и флуоресценции) устанавливали щели: экситации – 3 нм, эмиссии – 20 нм (позиция измерений «NSt»). Выбор ширины щелей был обусловлен, главным образом, рекомендациями, изложенными в инструкции по эксплуатации спектрофлуориметра. Интенсивности флуоресценции (F) в относительных единицах, полученные при использовании вышеупомянутых позиций измерений, в случае необходимости можно было сопоставить между собой. Экспериментально нами был выведен коэффициент перерасчета, который со-

ставлял примерно 2,5 (FNSt = 2,5 FSt). Все измерения проводили при комнатной температуре.

Для исследованных растворов выполнялась линейная зависимость между интенсивностью их люминесценции и концентрацией люминесцирующего вещества, т.к. в разбавленных растворах концентрационное тушение РОВ отсутствует (Люцарев, Федосов, 1970; Карабашев, 1987; Левшин, Салецкий, 1994; Артюхов, Путинцева, 1996).

3.3. Выполнение измерений на флуоресцентном анализаторе жидкости «Флуорат-02-3М»

В силу ряда объективных причин целый ряд экспериментов, особенно на начальной фазе наших исследований по данной тематике, мы проводили с использованием флуоресцентного анализатора жидкости «Флуорат- 02-3М», который реально снижает информативность регистрации спектральных характеристик по отношению к спектрофлуориметру, но является стандартизированным средством контроля качества водной среды.

50

Анализатор жидкости предназначен для измерения массовой концентрации неорганических и органических примесей в воде, а также в воздухе, почве, технических материалах, продуктах питания после переведения примесей в раствор. Область применения – аналитический контроль объектов окружающей среды, санитарный контроль и контроль технологических процессов. Прибор регистрирует интенсивность отдельных спектральных полос флуоресценции анализируемого соединения в зависимости от подбора специальных узкополосных светофильтров.

Некоторые основные технические данные анализатора: спектральный диапазон оптического излучения, используемого для анализа в канале возбуждения, составляет 200–650 нм, в канале регистрации флуоресценции – 250–650 нм; объем анализируемой пробы – 3 мл, время измерения – не более 3 с, источник питания – ксеноновая лампа, диапазоны измерения для флуориметрического метода измерения массовой концентрации фенола в воде от 0,01 до 25 мг/л. Оптическая схема прибора может быть условно разбита на три канала: пропускания, опорный и регистрации. Под действием излучения ксеноновой лампы в кювете с образцом происходит возбуждение фотолюминесценции (флуоресценции) растворенных веществ. В канале регистрации излучение люминесцирующих компонентов пробы из кварцевой кюветы проходит через светофильтр, выделяющий спектральную область регистрации, узел механической блокировки и попадает на приемник излучения канала регистрации люминесценции – фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Электрический сигнал этого приемника зависит от концентрации и состава определяемых веществ в растворе и называется сигналом люминесценции (флуоресценции).

Анализатор комплектуется набором светофильтров с узким полосами пропускания в отдельных областях спектра: № 1 – с максимумом пропускания на длине волны 266 нм, № 3 – 314 нм, № 5 – 534 нм, № 7 – 376 нм, № 15 – 452 нм, № 19 – 500 нм и др. Фильтры № 1 и № 7 использовали для выделения спектральной области возбуждения фотолюминесценции. Фильтры № 3, 5, 15, 19 применяли для выделения спектральных полос регистрации. Полосы пропускания светофильтров не приводятся в техническом описании флуоресцентного анализатора, поэтому они были определены нами экспериментально на спектрофотометре «СФ-26» отечественного производства.

Порядок работы на «Флуорате» приводится в его техническом описании. В общем виде выполнение измерений заключается в следующем: 1) в канале возбуждения и регистрации устанавливают соответствующие светофильтры, пробу воды наливают в кювету и помещают в кюветное отделение, после чего закрывают крышку кюветного отделения; 2) на микропроцессоре прибора входят в меню «Выбор метода», устанавливают метод «Люминесценция», затем входят в меню «Градуировка» и устанавливают значения параметров «С0» – «С6» и «J0» – «J6» равными нулю. Далее пе-

51

ремещают курсор на ячейку со значением параметра «J0» и нажимают клавишу «Ent», при этом измеряется интенсивность флуоресценции фонового раствора, в роли которого выступает исследуемая нами вода. Анализатор жидкости «Флюорат-02-3М» также применяли для определения содержания нефтепродуктов и анионных поверхностно-активных веществ.

3.4. Опыты с использованием планктонных водорослей

Объектом исследования служила альгологически чистая культура зеленой протококковой водоросли Chlorella vulgaris Beyer. Культивирование проводили в конических колбах емкостью 0,8 л в 300 мл среды. Водоросли выращивали на среде Успенского № 1. Активная реакция среды после стерилизации была 7,0–7,3. Железо и микроэлементы вносили в среду после стерилизации, непосредственно перед посевом (Хоботьев, Капков, 1971). Температура выращивания изменялась в пределах 22–24оС. Водоросли выращивали в люминостате со сменой дня и ночи с досвечиванием лампами дневного света при общей мощности светового потока до 5 тыс. лк (люкс). Во избежание оседания клеток водоросли на дно или же прикрепления к стенкам сосуда, а также для более усиленного растворения СО2 содержимое колб перемешивали встряхиванием несколько раз в сутки.

Как тест-объект использовали также лабораторную культуру морских одноклеточных золотистых водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin. Лабораторную культуру выращивали в люминостате в тех же, что и хлореллу колбах и объемах при освещении лампами дневного света интенсивностью 4–5 тыс. лк и световом режиме 12–14 ч. Культивирование водорослей проводили при температуре 18–20оС и солености 34,5‰ на питательной среде Гольдберга в модификации Кабановой (Временные методические.., 1999). Питательную среду готовили путем добавления в природную морскую воду из Баренцева моря четырех исходных растворов солей, приготовленных на дистиллированной воде. Морскую воду отбирали в условно чистом районе моря, фильтровали через двойной бумажный фильтр, аэрировали на протяжении 10 суток и стерилизовали последовательным трехкратным нагреванием на водяной бане в течение 20 мин при температуре 73–80оС. В стерилизованную морскую воду после охлаждения добавляли растворы минеральных солей согласно указанной методике (Временные методические.., 1999).

Поскольку культура золотистых водорослей была получена нами из ВНИРО, где она культивируется при солености около 26‰, ее адаптировали к солености баренцевоморской воды, используемой для экспериментов (34,5‰). Адаптацию Ph. tricornutum к среде с нужной соленостью проводили по схеме, описанной в стандартной методике (Временные методические.., 1999).

52

В качестве основного биологического показателя состояния культур исследованных одноклеточных водорослей использовали изменение общей численности их клеток. Число клеток считали в счетной камере Горяева в 25 больших квадратах, а затем проводили пересчет на 1 мл согласно стандартной методике (Методические рекомендации.., 1998). Общую численность клеток в итоге выражали в десятках тысяч штук в 1 мл.

Для исследования влияния процессов интоксикации на динамику флуоресцирующих экзометаболитов водных организмов как стандартный токсикант использовали раствор бихромата калия, или калия двухромовокислого. В настоящее время во многих странах, в том числе и в России, в целях стандартизации методов биотестирования и получения высокой сходимости результатов различных исследований используются эталонные химические соединения, к числу которых относятся и соединения хрома шестивалентного (Методические рекомендации.., 1998; Dorn et al., 1987; Wang, 1987). Токсикант вносили в опыты в виде водного раствора; его концентрацию рассчитывали на ион хрома (VI).

Токсический эффект влияния хрома на динамику внешнего метаболизма водорослей был исследован на примере Chlorella vulgaris. Водоросль хлорелла является одним из широко применяемых тест-объектов в водной токсикологии. Ее высокая чувствительность и быстрая реакция на токсическое воздействие, хорошая повторяемость получаемых результатов, наряду с высокой скоростью размножения, способностью расти на искусственных средах и удобством культивирования в лабораторных условиях, предопределили выбор данного объекта для наших опытов (Хоботьев, Капков, 1971). Исследования проводили в диапазоне концентраций 0,01–5,0 мгCr/л. Токсикант в опытах на водорослях вносили на лаг-фазе развития культур. Длительность экспериментов составила от 10 до 56 суток. Опыты ставили в трех повторностях.

Дополнительно был поставлен эксперимент с Chlorella vulgaris, в котором водоросли росли на биологизированной воде. Воду для эксперимента брали из существующего длительное время лабораторного аквариума из расчета 50% воды из аквариума и 50% отстоянной водопроводной воды. Для лучшего роста хлореллы в воду были внесены минеральные соли по рецептуре, соответствующей среде Успенского № 1. Опыт ставили в двухкратной повторности. Продолжительность эксперимента – 18 суток.

3.5. Опыты с использованием элодеи

Элодея (Elodea canadensis Rich.) – представитель погруженных сосудистых растений, прикрепленных ко дну корешками. Широко распространена в стоячих водоемах умереной зоны. Теневынослива, полнее утилизирует сине-фиолетовую, чем красную часть спектра. Размножается пре-

53

имущественно вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов (Потапов, 1950).

Для удаления влияния фонового свечения природной (водопроводной) воды на флуоресценцию экзометаболитов элодеи приводили эксперимент с культивированием растения на среде Успенского № 1 с двукратной концентрацией минеральных солей ( 2). В опыт отбирали черенки от верхней части основного побега элодеи длиной 14 см без боковых отростков и корней. Перед посадкой растения промывали и выдерживали в течение 30 минут в дистиллированной воде, чтобы по возможности избавиться от присутствия микроорганизмов, особенно водорослей. Побеги элодеи в количестве 2 штук помещали в кристаллизаторы объемом 1 л с 700 мл среды. Сосуды располагали у окон на дневном рассеянном свету с освещенностью не менее 1 500 лк при температуре 18–24оС в соответствии с требованиями стандартной методики (Король, 1989; Методические рекомендации.., 1998).

Для оценки влияния токсичности на экзометаболическую активность элодеи использовали так же, как и в случае с водорослями, бихромат калия в концентрациях 0,1 и 1,0 мг/л в пересчете на ион хрома. Опыт и контроль ставили в трехкратной повторности. Положенную по стандартной методике смену воды в опыте и контроле не проводили, так как этого требовали условия эксперимента. Во избежание концентрирования среды, перед забором проб на флуоресцентный анализ частично испарившуюся из кристаллизаторов жидкость доводили до исходного уровня дистиллированной водой. Кроме спектральных показателей, состояние элодеи в эксперименте оценивали по следующим параметрам: состояние растений (изменение окраски и др.), прирост основного побега, число корней и их длина. Время появления корней отмечали особо (Методические рекомендации.., 1998). Общая продолжительность опыта составила 48 суток.

3.6.Опыты с использованием беспозвоночных

Вкачестве тест-объекта была использована Daphnia magna Straus, которая является представителем ветвистоусых ракообразных (Cladocera). Этот вид является важнейшей составной частью пресноводного зоопланктона, служит источником пищи молоди рыб и, являясь фильтратором, выполняет активную роль в процессах самоочищения водоемов. Рачки вида D. magna имеют более крупные размеры, чем другие виды, и их применение в экспериментах предпочтительно. Они обитают в стоячих и слабопроточных водоемах. Являются типичными мезосапробами, переносят состояние осолонения до 6 ‰ (Мануйлова, 1964).

54

При содержании лабораторных культур рачков были созданы и поддерживались следующие оптимальные условия: температурный режим 20±2оС; световой день 10 часов при естественном освещении с досвечиванием лампами дневного света; содержание кислорода в используемой воде 6–7 мг/л, pH – 7,0–8,2. Для культивирования D. magna и постановки опытов использовалась водопроводная вода после удаления из нее остаточного хлора и биологизации. Это достигалось путем длительного продувания воздуха в аквариуме с помощью микрокомпрессора (14 дней). На дно аквариума засыпался хорошо промытый речной песок, помещались веточки элодеи. В качестве корма для дафний использовали зеленые протококковые водоросли Chlorella sp. (Исакова, Колосова, 1988). Водоросли ежедневно вносили из такого расчета, чтобы они практически полностью выедались дафниями до следующего кормления. Присутствие клеток водорослей в экспериментах с ракообразными периодически контролировали под микроскопом.

Эксперименты проводили в стаканах емкостью 250 мл с объемом воды 200 мл. Для посадки использовали молодь дафний одного возраста (3-х дневных). Количество дафний в разных опытах составляло 7–9 штук. Опыты ставили в трех повторностях. В ходе экспериментов замену среды не производили. По мере испарения воды из экспериментальных емкостей перед забором проб на флуоресцентный анализ во избежание концентрирования среды в стаканы добавляли дистиллированную воду до исходного уровня. В качестве основных биологических показателей отмечали выживаемость дафний и количество появляющейся молоди с дальнейшим перерасчетом на одну самку. Молодь после подсчета удаляли. Исследование полос флуоресценции водных сред в присутствии ракообразных проводили как при нормальном развитии культуры, так и в условиях токсикологического стресса. В качестве токсикантов использовали калий двухромовокислый и медь сернокислую в концентрациях 0,01 мг/л, рассчитанных на ион хрома и меди соответственно. Концентрацию токсикантов подбирали из расчета оказания ею хронического сублетального действия: не приводящего к гибели дафний, но вызывающего физиологические нарушения. Полосы флуоресценции измеряли на «Флуорате» при следующих сочетаниях светофильтров возбуждения/регистрации: 266/314, 376/452, 376/500 и 376/534. Продолжительность экспериментов составляла при интоксикации хромом 21 сутки и медью – 12 суток. В эксперименте с медью дафний отсаживали спустя 5 суток экспозиции с тем, чтобы оценить возможный вклад микрофлоры в остаточную динамику флуоресцирующей части РОВ.

Для уточнения отдельных фактов, полученных в предыдущих экспериментах, был поставлен отдельный опыт для анализа состояния, так называемой «воды скоплений» (Эффект группы.., 1976). Количество дафний в стакане увеличивали до 13 штук. Опыты ставили в двух сериях и трех повторностях. Рачков кормили до 5 суток экспозиции включительно. Затем

55

из одной серии опыта после 5-х суток дафний удаляли, в другой их оставляли, периодически изымая молодь. Общее время экспозиции в данном эксперименте составило 21 сутки.

3.7. Эксперимент на лабораторном микрокосме

Пресноводный микрокосм представлял собой два аквариума емкостью по 50 литров каждый и включал следующих обитателей: брюхоногих моллюсков Anisus vortex, ветвистоусых ракообразных Daphnia magna, ко-

ловраток Vorticella sp., инфузорий Euplotes sp. и Paramecium sp., зеленые водоросли при доминировании хлореллы и элодею (Elodea canadensis). Воду для экспериментальных емкостей и посадочный живой материал брали из исходного лабораторного, существующего длительное время аквариума, емкостью около 100 л из расчета 50% воды из большого аквариума и 50% отстоянной водопроводной воды. В экспериментальные емкости помещали моллюсков и ракообразных по 25 и 30 штук соответственно, побеги элодеи с сырой биомассой по 25,5 г. Исходная численность клеток Chlorella sp. в микрокосме оказалась равной в среднем 36,4 тыс. клеток/мл. Один из аквариумов был затравлен бихроматом калия в концентрации 0,02 мгCr/л. Второй аквариум представлял собой обычный контроль с целью наблюдения за нормальным ростом и развитием его обитателей. Длительность эксперимента с микрокосмом составила 44 дня.

Измерение полос флуоресценции проводили на «Флюорате», используя наборы светофильтров при следующих сочетаниях параметров возбу-

ждения/регистрации: 266/314, 376/452, 376/500 и 376/534. В экспериментах с микрокосмами также регистрировали: у моллюсков, ракообразных и элодеи прирост сырой биомассы в начале и конце опыта. У элодеи определяли длину появившихся корней. Численность клеток хлореллы просчитывали периодически при одновременном измерении флуоресценции среды.

3.8. Гидрохимические исследования природных вод

Параллельно со спектральными характеристиками в пробах природной воды определяли бихроматную окисляемость (БО) по стандартной методике (Руководство по химическому анализу.., 1977), содержание нефтепродуктов и анионных поверхностно-активных веществ (АПАВ). Бихроматную окисляемость дополнительно пересчитывали на общее содержание РОВ с применением коэффициента 0,75, предложенного Б.А. Скопинцевым (Скопинцев, 1950).

Для определения содержания нефтепродуктов и анионных поверхно- стно-активных веществ применяли, как было указано выше, анализатор жид-

56

кости «Флюорат-02-3М». Указанные измерения проводили в рамках комплексного флуоресцентного анализа вод с целью дальнейшего возможного сопоставления полученных результатов по загрязняющим агентам с данным по флуоресценции РОВ. Прибор позволяет измерять концентрации нефтепродуктов и поверхностно-активных веществ в диапазонах 0,005–50 мг/дм3 и 0,025–2 мг/дм3 соответственно. Флуориметрические методы измерения массовой концентрации нефтепродуктов и АПАВ основаны на экстракции их из анализируемой пробы и определении содержания соединений по интенсивности флуоресценции полученных экстрактов в соответствии с сертифицированными методиками (Методика выполнения измерений.., 1998; Методика выполнения измерения.., 1998). Нефтепродукты экстрагировали гексаном, а АПАВ – хлороформом с красителем (трипафлавином). Следует отметить, что определению нефтепродуктов не мешают жиры, гуминовые вещества и насыщенные углеводороды природного происхождения.

57

ГЛАВА 4

ХАРАКТЕР И ДИНАМИКА СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ВОДНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВОДНЫХ РАСТЕНИЙ

4.1. Исследования на культурах водорослей

Динамика развития культур исследованных одноклеточных планктонных водорослей в экспериментах в целом описывалась стандартными S-образными кривыми. Рост Chorella vulgaris имел преимущественно логистический характер (рис. 6, кривая «контроль»). Рост культуры Phaeodactylum tricornutum приближался к экспоненциальному (рис. 7).

Общий характер спектров флуоресценции РОВ в культуральных средах оказался сходным для обоих исследованных объектов. Уровень излучения был значительным. На представленных спектрах (рис. 8, 9) наблюдаются две главные широкие бесструктурные полосы излучения: первая – с максимумом около 300–332 нм, вторая – с максимумом порядка 420–432 нм. Учитывая изменчивость этих полос флуоресценции, а также некоторые трудности выделения точек минимума на спектрах, мы не использовали в работе обычно применяемую характеристику такую, как полуширина спектральных полос (ширина на половине высоты).

Для первой полосы излучения были характерны сильные колебания по высоте и смещение максимума в ту или иную сторону, что говорит как о количественных, так и о некоторых качественных изменениях в составе соединений, флуоресцирующих в данном диапазоне. Как следует из рисунков 6, 9 и 7, 8 максимум выделения флуоресцирующих метаболитов в пересчете на клетку приходится в обоих экспериментах на 5–6 сутки, т.е. на конец лаг- – самое начало логарифмической фазы роста культур. В этот период выделительная активность водорослей, очевидно, достигает наивысших показателей, что вполне согласуется с данными литературы (Максимова, Пименова, 1969; Максимова и др., 1984; Зимина, Сазыкина, 1987; Плеханов, Максимова, 1997). Для лучшей иллюстрации выделения в ходе экпериментов флуоресцирующих на длинах волн 300–332 нм экзометаболитов построены графики динамики уровня свечения коротковолновых максимумов флуоресценции минеральных сред в присутствии зеленых и золотистых водорослей (рис. 10, 11). Обращает на себя внимание сходство динамики содержания РОВ для исследованных культур водорослей (по крайней мере до 19–20 суток). Для обеих кривых при нормальном развитии культур характерна некоторая общая тенденция нарастания содержания флуоресцирующих соединений в культуральной среде по мере роста численности водорослей и специфическое обратное их поглощение клетками в период 6–10 и 18–20 суток.

58