SRCWFBHKn8

Вторая полоса излучения обладала большей стабильностью. Она развивалась по мере нарастания плотности культур водорослей, достигая максимума на середине логарифмической фазы роста (14–18 сутки). Затем, по мере выхода культур на стационарную фазу, вторая полоса излучения постепенно сходила на нет. Длина волны второго пика в каждом отдельном опыте практически не менялась. Это позволило представить графики динамики колебания уровня свечения этих полос на конкретных длинах волн регистрации (рис. 12, 13). При сравнении последних с рисунками 10 и 11 соответственно, легко обнаруживается их значительное сходство, особенно в пределах 20-х суток экспозиции. К сожалению, по не зависящим от нас причинам, опыт с Phaeodactylum пришлось прервать на 19-е сутки. Однако, мы предполагаем, что по мере выхода данной культуры на стационарную фазу роста сходство в динамике содержания экзометаболитов в среде с культурой Chlorella также было бы обнаружено. Это предположение основывается на анализе данных литературы. Таким образом, на начальном и конечном этапах фазы логарифмического роста культур одноклеточных водорослей происходит интенсивное обратное поглощение экзометаболитов их клетками. Явление поглощения органических соединений водорослями на логарифмической фазе развития также встречается в исследованиях ряда авторов (Раймонт, 1983; Зимина, Сазыкина, 1987; Плеханов, Мак-

симова, 1997).

Рис. 12. Динамика уровня свечения среды в спектральной области 432 нм в присутствии Chlorella, отн. ед.

62

ны волны соединений с определенной молекулярной массой. Так, в работе В.Е. Синельникова и А.Н. Хмылева (1987) показано, что при изменении длины волны возбуждающего света с 365 нм до 312 нм максимум полосы флуоресценции группы соединений, именуемых «первичным гумусом», сдвигался с 470 на 425 нм соответственно. Аналогичные данные были получены и для морских вод (Карабашев, 1987). Такой сдвиг максимума флуоресценции, разумеется, не беспределен. На основании собственных испытаний и данных литературы установлено, что при изменении длины волны возбуждения от 250 до 365 нм пик свечения первичного гумуса колеблется от 416 до 480 нм.

При сравнении данных исследования экспериментальных сред культивирования Chlorella и Phaeodactylum, следует помнить (см. методику), что параметры регистрации спектров этих объектов несколько отличались. Для сопоставления уровня свечения, надо абсолютные показатели флуоресценции в случае Phaeodactylum делить на 2,5. Из перерасчета следует, что уровень свечения для обоих объектов был примерно одинаков, во всяком случае для максимальных показателей. Однако, численность феодактилюма в эксперименте была заметно выше, чем хлореллы. Значит, экзометаболическая активность отдельных клеток зеленых пресноводных водорослей в отношении регистрируемых фракций РОВ была выше, чем у морских золотистых. Последнее представляется закономерным: как следует из обзора научной литературы, конкурентные отношения между микроорганизмами в пресноводных водоемах обычно представляются более насышенными, чем в морских. Отсюда возрастает и роль химической коммуникации в этих взаимоотношениях (Новиков, Харламова, 2000).

Ряд исследований, основная часть которых будет приведена ниже, был проведен с использованием флуоресцентного анализатора жидкости «Флуорат» (см. методику). Поэтому, для последующего сопоставления данных, полученных на разных приборах, мы приводим результаты эксперимента, где регистровались отдельные полосы флуоресценции среды Успенского № 1 при развитии культуры Chlorella vulgaris с использованием флуоресцентного анализатора. Как видно из рис. 14 динамика полосы флуоресценции 314 нм (возбуждение 266 нм) в целом соответствует таковой коротковолного максимума на рис. 10 и 11. Снижение содержания флуоресцирующих метаболитов также отмечено на 5–8 сутки экспозиции. Динамика остальных полос флуоресценции в целом развивалась синхронно с первой. Однако, по амплитудным характеристикам полосы флуоресценции 452, 500 и 534 (возбуждение 376 нм) были значительно ниже полосы 266/314 нм, чего не скажешь о спектральной области 266/432, регистрируемой на спектрофлуориметре (см., например, рис. 12). Данное обстоятельство косвенно указывает на неточность рекомендуемой подавляющим большинством исследователей длины волны возбуждения для изучения флуоресценции РОВ природных вод – около 370 нм.

64

Обращают на себя внимание колебания величин флуоресценции. Как видно из рис. 16 (кривая «контроль»), до 28-х суток экспозиции происходит в целом постоянное нарастание уровня свечения РОВ в среде: более интенсивное до 5-х и перед 28-ми сутками экспозиции. В период между этими этапами нарастание носило очень плавный характер. Очевидно, в данный период содержание флуоресцирующих соединений в растворе было пропорционально приросту биомассы самого растения (пассивная фаза выделения). После 28-х суток экспозиции началось активное обратное потребление флуоресцирующей фракции РОВ из среды.

Рост элодеи в контроле характеризовался следующими биологическими показателями: линейный прирост растения составил в среднем 3,3 см (19,1% к исходной длине), длина корней – 24 см; число корней составило в среднем 2,5 на одно растение. Такие биологические показатели элодеи в целом свидетельствуют о ее нормальном развитии в экспериментальных условиях (Биологические процессы.., 1984).

4.3. Структура и анализ происхождения спектров возбуждения флуоресценции водных сред

Для выяснения химической природы флуоресцирующих соединений были измерены и проанализированы спектры возбуждения. Спектры возбуждения в значительной мере отражают спектральные характеристики поглощения флуоресцирующих соединений, но более информативны в виду большей чувствительности и селективности (Левшин, Салецкий, 1994). Спектр поглощения чистой природной воды обычно малоинформативен и представляет собой гиперболическую кривую с резким возрастанием поглощения в дальней УФ-области (< 220–230 нм) (Иванов, 1975; Шифрин, 1983; Сидько и др., 1996; см. также Приложение 2).

Первое определение спектра возбуждения в пробах воды было сделано С.В. Люцаревым (1968), который получил его для морской воды в виде полосы с максимумом около 370 нм. Впоследствии эти спектры были несколько откорректированы Брауном (Brown, 1974) с использованием более высокочувствительной аппаратуры. Для природной морской воды (Балтийское море) он приводит исправленные спектры возбуждения, форма которых сходна с формой спектров поглощения желтого вещества: монотонный спад с ростом длины волны. Такие расхождения в характере спектров приводимых С.В. Люцаревым и М. Брауном в основном объясняются различиями в методиках их регистрации и вообще, по мнению Г.С. Карабашева (1987), по ряду соображений методического плана представляются весьма сложными для обсуждения.

Исследованные нами спектры возбуждения полос флуоресценции с пиками 300–328, 420–432 и 508 нм были относительно устойчивыми в том

67

смысле, что положение максимумов в них практически не изменялось. На рис. 17 представлены спектры возбуждения минеральных сред при развитии культур хлореллы, замеренные на максимумах регистрации (эмиссии) 328 и 432 нм, и феодактилюма – на 300 и 424 нм. На рис. 18 отображен спектр возбуждения элодеи; второй спектр при длине волны регистрации более 400 нм не строили из-за слабой выраженности данной полосы свечения. При обсуждении вопросов, связанных со спектрами возбуждения мы не будем затрагивать тему динамики уровня их свечения, т.к. это отдельная проблема, изучение которой не входило в задачи нашего исследования.

Рис. 17. Cпектры возбуждения экспериментальных сред при различных длинах волн регистрации (Em, нм), отн. ед.

Как видно из рис. 17, первая основная полоса флуоресценции имела две полосы возбуждения: первая с максимумом при 232–236 нм и вторая при 270–282 нм. Возможно, что присутствие указанных пиков связано с наличием в составе флуоресцирующей фракции двух групп соединений, поглощающих в данных областях. Именно наличие двух групп соединений, формирующих одну общую полосу флуоресценции, может при попеременном их преобладании сдвигать максимум этой полосы в ту или иную сторону. На основании ряда данных (Аналитические методы.., 1963; Гордон, Форд, 1976; Справочник биохимика, 1991; Артюхов, Путинцева, 1996) можно предположить, что излучение с пиками на длинах волн 300–328 нм испускается ароматическими карбоновыми кислотами типа коричных и феноловых (пик поглощения около 236 нм с коэффициентом экстинкции

68

= 9 400–10 000), а также аминокислотами тирозином и триптофаном. Тирозин имеет следующие пики поглощения: 240 нм с 11 050 и 293,5 с 2 330. Для триптофана известны три пика поглощения в ультрафиолето-

вой области: 218 нм с 33 500, 278 нм с 5 550 и 287,5 нм с 4 550. По-

следнее согласуется с данными К.М. Хайлова (1970), показавшего, что экзометаболиты одноклеточных водорослей в значительной мере состоят из белков и пептидов, для идентификации которых он использовал показатели поглощения света на длинах волн 230 и 280 нм.

Рис. 18. Спектр возбуждения среды в присутствии элодеи при длине волны регистрации 328 нм, отн. ед.

По мнению некоторых авторов (Daglay, Johnson, 1956) аминокислоты накапливаются в культуральной жидкости из-за превышения их синтеза над использованием клетками. Однако, по нашему мнению, совпадающему также с мнением В.С. Злобина (1976), интенсивный обмен аминокислот между средой и клеткой предполагает скорее наличие механизмов избирательного выделения и поглощения этих веществ для поддержания активного баланса свободных и связанных аминокислот при изменении факторов среды обитания.

Более длинноволновая полоса флуоресценции с пиком 420–432 нм вызвана свечением группы веществ, имеющих два пика поглощения – около 252 и 330 нм. Интерпретация фиолетовой флуоресценции с позиций качественного анализа затруднена. В литературе есть указания на то, что такие параметры флуоресценции и поглощения могут иметь ароматические соединения с конденсированными ядрами (би- и трициклические арены).

69