SRCWFBHKn8

Калле (Kalle, 1962) установил, что некоторые соединения, входящие

всостав желтого вещества, флуоресцируют синим светом при возбуждении их УФ излучением. Флуоресцирующая компонента составляет лишь часть желтого вещества: все, что флуоресцирует, поглощает, но не все, что поглощает – флуоресцирует. Интенсивность флуоресценции обычно значительно возрастает с глубиной (исключая лишь очень продуктивные рай-

оны) (Иванов, 1978); κжв (390) если и возрастает с глубиной, то гораздо слабее. Таким образом, типичным для океана является увеличение по вертикали относительной доли флуоресцирующей составляющей в желтом веществе, т.е. накопление с глубиной, по-видимому, более стойкой компоненты растворенной органики. Похожую ситуацию Калле наблюдал в Балтийском море при переходе от прибрежных вод к морским – отношение флуоресценция/поглощение при удалении от берега с увеличением солености увеличивалась (Kalle, 1966).

Впервые спектры флуоресценции морской воды измерил С.В. Люцарев (1968) на пробах воды из Каспийского моря и Атлантического океана. Спектры свечения он регистрировал на примитивном спектрофлуориметре после упаривания вод примерно в 20 раз при возбуждении линией ртути 365 нм. Записи спектров разных проб отличались по интенсивности, параметры спектральных полос оказались сходными. В среднем максимум флуоресценции находился при 463 нм, а полуширина полос составляла 130 нм (Люцарев, 1968; Люцарев, Федосов, 1970). Аналогичные результаты позже были получены Брауном (Brown, 1974) на водах Балтийского моря.

Сучетом найденных значений излучательного времени жизни возбужденного состояния и на основании теории вращательной деполяризации флуоресценции сферических молекул Левшина-Перрена можно сделать предварительный вывод о том, что в морской воде флуоресцируют преимущественно низко- и среднемолекулярная фракции РОВ. Зависимость квантового выхода от внешних условий, или тушение флуоресценции, изучено недостаточно (Оптика океана, 1983). Отсутствие концентрационного тушения было доказано С.В. Люцаревым (1968) и Брауном (Brown, 1974) на пробах воды из Балтийского и Каспийского морей с большим содержанием РОВ, где такое тушение наиболее вероятно. Флуоресценцию органических соединений способны тушить ионы галогенов и растворенный кислород, но их действие на свечение РОВ не исследовано. Оценка корреляции между содержанием растворенного кислорода и флуоресценцией свидетельствует о том, что тушение последней кислородом незначительно, если вообще имеет место (Карабашев и др., 1971; Карабашев и др., 1974).

Оценка светопоглощающей способности собственно воды, взвешенных и растворенных веществ мезо- и эвтрофных водоемов показывает, что

вкоротковолновой области видимого диапазона она в значительной степени обусловлена растворенным ЖВ (Иванов, 1975; Иванов, 1978; Оптика океана, 1983; Шифрин, 1983; Карабашев, 1987; Кондратьев, Поздняков,

40

1988; Ершова, Копелевич, 1999) и в десятки и сотни раз превышает поглощение света чистой водой, в несколько раз хлорофиллом и каротиноидами фитопланктона. Так согласно данным, полученным на пресных водах, в области 400–500 нм показатели светопоглощения собственно водой не превышают 0,02 м-1, показатели поглощения света пигментами фитопланктона при концентрации хлорофилла Схл < 10–20 мг/м не превышают 0,40 м- 1, в то время как показатели светопоглощения ЖВ колеблются от десятых долей до нескольких м-1 (Cидько и др., 1996).

Изучение связи спектральных показателей ослабления светопропускания ε (λ) в пробах природных вод с поглощающей способностью содержащегося в воде ЖВ показывает, что вклад поглощения ЖВ в общее ослабление света в области λ = 400 нм может составлять > 50 % ε400. Поэтому ориентировочно значения показателей светопоглощения можно оценивать по формуле:

где к1 – коэффициент пропорциональности (для воды Енисея к1 ≈ 0,75 при показателе рассеяния σ ≈ 0,09), ε400 и ε550 – показатели ослабления светопропускания пробами воды при длинах волн 400 и 550 нм соответственно) (Сидько и др., 1996).

По мнению Б.А. Скопинцева (1979), работы, посвященные изучению содержания в водах суши определенных органических соединений и оценки доли их участия во всей массе растворенного органического вещества, весьма малочисленны. В то же время количество аналогичных работ в водах морей и океанов значительно больше, и их число продолжает расти. В результате автору удалось установить, что в расчете на всю толщу океана известные органические соединения составляют лишь около 10% от суммарного органического вещества (ОВ), остальное приходится на долю неизвестного, но относительно устойчивого ОВ – водного гумуса.

Применение химических методов исследования в свою очередь показало различие химического состава ОВ пресноводных сапропелей и морских донных отложений по сравнению с почвенным гумусом. Было установлено, что в основе так называемых гуминовых кислот сапропелей заложена алифатическая или ациклическая структура; в то же время гуминовые кислоты торфа, лигнитов и каменных углей в основном построены из циклических – ароматических ядер (Караваев, Будяк, 1960). Можно предположить, что такое же различие химического состава имеет место в гумусе планктонной и терригенной природы (Скопинцев, 1979).

О непременности образования при распаде отмершего планктона и его остатков устойчивого растворенного ОВ свидетельствует его наличие в водах океанов. Представление о преобладающей роли планктона в формировании водного гумуса подтверждается результатами определения отно-

41

сительного содержания стабильного изотопа С13 в тихоокеанском планктоне (Degens et al., 1968) и в растворенном и взвешенном ОВ вод северовосточной части Тихого океана (Williams, Gordon, 1970). Вильямс и Гордон (1970), сопоставив значения С13 в выделенной из планктона «целлюлозе» (–22,4%) и «лигнине» (–23,1%) с величинами С13 в растворенном (от –21,2 до –24,4%) и взвешенном (от –22,0 до –24,3%) органическом веществе в водах океана, обратили внимание на их близость. Следует отметить, что морские организмы по органическому углероду почти на 10% «тяжелее» наземных растений; в последних величина С13 колеблется от 25 до 27% (Дегенс, 1971). Характерно, что и в так называемых гумусовых веществах, выделенных из морских донных отложений, величина С13 ближе к таковой в планктоне, а в почвенном гумусе соответственно его происхождению из наземных растений величина С13 ближе к таковой в наземных растениях (Дегенс, 1971; Скопинцев и др., 1979). Общность гумусовых веществ в почвенном гумусе и в морских донных отложениях, очевидно, ограничивается лишь идентичностью способа их выделения; происхождение и химический состав их различны. Тоже, по-видимому, можно сказать и о растворенном органическом веществе тех открытых водоемов суши, в которых основным его источником является планктон (Скопинцев и др., 1979).

Норвежские исследователи (Dalloken et al., 1995) наглядно показали, что спектр ослабления падающей солнечной радиации с глубиной сильно зависит от степени развития морского фитопланктона. В периоды до и после массового цветения фитопланктона (Гренландское море) полоса минимального ослабления света с глубиной располагается в пределах 440–520 нм с максимумом в сине-зеленой области около 488 нм. Это соответствует общепринятым представлениям для чистой морской воды. В период же цветения фитопланктона (концентрация хлорофилла а порядка 4 мг/м3) эта полоса сдвигается в зеленую область: 520–565 нм с максимумом около 550 нм. Из данных следует, что полоса минимального ослабления не только сдвигается вправо, но и сужается, главным образом, за счет резкого снижения пропускания в синей и сине-зеленой областях спектра, обусловленного поглощением хлорофилла и желтого вещества, выделяемого фитопланктоном. Авторы показали также, что доля ослабления света желтым веществом, например, при длине волны 520 нм возрастает при цветении водорослей от 2 до 30% (Dalloken et al., 1995).

Первоначальный вид органических веществ существенно изменяется в результате фотохимического их окисления под действием ультрафиолетового излучения солнца и кислорода окружающей среды. В результате этого для растворенных органических веществ в природных водах, в том числе и морских, характерно наличие окисленных их форм и, в первую очередь, карбонильных групп. Аналогичное явление наблюдается для многих бесцветных жидких органических веществ, спектры люминесценции

42

которых очень сходны, но интенсивность их различна. Характерная «универсальная» фиолетовая флуоресценция приписывается окисленным органическим соединениям, содержащим карбонильные группы (Карякин, Грибовская, 1987).

М.А. Константинова-Шлезингер (1961) приводит большой перечень соединений, светящихся в области 260–400 нм. В наиболее коротковолновой области располагается спектр флуоресценции бензола. В области 270–350 нм флуоресцируют соединения с одним ароматическим кольцом и короткими боковыми группами: галоидпроизводные бензола, этилбензол, пропилбензол, фенол, ксилолы, крезолы, стирол, анилин и др. Соединения с двумя конденсированными ароматическими ядрами (нафталин и его производные, нафтолы флуоресцируют в области 340–420 нм (Люминесцентный анализ, 1961; Теренин, 1974). Известна флуоресценция производных бензола, содержащих гидроксильную, карбоксильную или карбонильную группы, а также соединений с изолированными бензольными ядрами (дифенилов) и гетероциклических соединений с одним или двумя кольцами (пиридин, хинолин, индол). По мнению В.Е. Синельникова (1972), флуоресценция в ультрафиолетовой области спектра отражает присутствие в воде достаточно определенной группы веществ неприродного происхождения, чаще всего связанных с промышленным синтезом (Синельников, 1972б).

Одним из признаков поступления нефтепродуктов в водоем является интенсивная флуоресценция воды в ультрафиолетовой (300–370 нм) и видимой (400–490 нм) областях спектра (Синельников, 1972б, 1980).

Согласно данным, полученным Л.Ф. Зуриной и др. (1973), значительные поглощения в области длин волн 220–300 нм обнаруживают смолистые компоненты нефти (битумы), лигнин, пуриновые и пиримидиновые основания, растительные пигменты. Исследования спектров поглощения различных нефтепродуктов в ультрафиолетовой области показали, что они представляют собой гиперболические кривые с небольшим пиком в области 255–260 нм (Зурина и др., 1973). По данным А.А. Назаровой и др. (1977) большинство изученных органических веществ как естественного происхождения, так и внесенных деятельностью человека имеют максимальное поглощение при 260–280 нм (табл. 5) (Назарова и др., 1977).

Опыты на природных водах показали, при возбуждении линиями ртути 284,7 и 295,5 нм появлялась флуоресценция добавленных к воде фенола, нафталина и его метилпроизводных, содержащихся в бензине и керосине. Возбуждение в этой области спектра пригодно для выделения флуоресценции моно- и бициклических соединений. При облучении образцов линией ртути 253,6 нм флуоресценция в водах водохранилищ и в экстрактах из них не возбуждалась. В экстрактах из воды р. Клязьмы ниже г. Щелково возникала флуоресценция в области 290 нм (Синельников, 1972б).

Таблица 5

43

Светопоглощение в УФ-области спектра водных растворов некоторых классов органических веществ (l = 10 мм)

Спектр флуоресценции вод р. Клязьмы имеет широкополосный максимум в области 340–350 нм. Ассиметричность спектра указывает на то, что он обусловлен суммой соединений, флуоресцирующих в области 340–450 нм, относящейся к циклическим соединениям с двумя-тремя кольцами. Содержание фенола на этом участке составляло 0,20–0,04 мг/л (Синельников, 1972б).

При возбуждении флуоресценции воды линией 270 нм регистрируется свечение моноциклических производных бензола (фенола, стирола, анилина и др.) в областях 290–390 и 340–415 нм – производных нафталина (Синельников, 1972а; Синельников, Бреусов, 1973); флуоресценция в области 340–415 нм характерна для легких нефтепродуктов (керосина и масел). В воде реки они имеют общую полосу флуоресценции 290–425 нм с максимумом в области 340–390 нм. Максимум флуоресценции моно- и бициклических ароматических углеводородов и их производных смещен в более коротковолновую область на 30–80 нм по сравнению с «первичным гумусом». Максимум флуоресценции фульвокислоты находится при 480–500 нм, гуминовой кислоты – при 500–540 нм (возбуждение – 365 нм). Интенсивность флуоресценции фракций гумусовых веществ различается в 20–50 раз и отличается от люмогенов промышленного синтеза в 60–300 раз (Синельников, Хмылев, 1987).

Флуоресценция природной воды в видимой области спектра связана в основном с гумусовыми веществами. Их спектр охватывает область длин волн от фиолетовой до красной (Синельников, Рыжиков, 1966). В водах со средней и высокой цветностью (более 50°) флуоресценция гумусовых веществ маскирует свечение других соединений. В ультрафиолетовой облас-

44

ти спектра гумусовые вещества, по мнению В.Е. Синельникова и Н.Г. Бреусова (1973), не флуоресцируют.

Ввидимой области при возбуждении линией ртути 365 нм спектры флуоресценции вод малых водохранилищ канала им. Москвы, а также Иваньковского, Угличского, Рыбинского водохранилищ представляли собой широкие бесструктурные полосы, охватывающие область 400–600 нм

смаксимумом излучения при 470 нм (Синельников, Рыжиков, 1966). Близкий по структуре спектр флуоресценции оказался у растворенной в воде фульвокислоты, выделенной из дерново-подзолистой почвы.

При возбуждении флуоресценции воды линией ртути 312 нм максимум в спектре флуоресценции сдвигается в более коротковолновую область – 425 нм. Близкий максимум флуоресценции (400–425 нм) имеют окрашенные вещества, трансформирующиеся из растительных остатков и детрита – первичное гумусовое вещество (Синельников, Хмылев, 1987).

Флуоресценцию первичного гумуса измеряли в области 420 нм. Он представляет собой, главным образом, сумму фенольных соединений из водорослей и высших растений (по Л.А. Сиренко «синее вещество»). Эти вещества с углеводами образуют продукты первой стадии гумификации со средней относительной молекулярной массой около 500. Флуоресценцию светлого гумуса фульвокислоты со средней относительной массой около 1 000 измеряли в области 480 нм («желтое вещество» по Калле). Темный гумус представляет смесь фульвокислот и гуминовых кислот со средней молекулярной относительной массой около 5–2 тыс.; максимум флуоресценции 520 нм. В сухом виде выделенные из воды они отличаются от других фракций гумуса интенсивной темно-коричневой или черной окраской (Синельников, Хмылев, 1987).

Вспектре флуоресценции для всех образцов воды района Волжского и Сбросного плесов Рыбинского водохранилища отмечался широкополос-

ный максимум в области 450 нм (максимум длины волны возбуждения 360 нм). Аналогичный максимум флуоресценции был характерен для спектра раствора фульвокислот (Синельников, 1966).

При возбуждении флуоресценции чистой артезианской воды коротковолновой областью спектра (275 нм) проявляется флуоресценция первичных гумусовых веществ с максимумом в области 450 нм, а также флуоресценция группы бесцветных соединений, спектр которых охватывает всю область наблюдений от 300 до 550 нм и частично накладывается на флуоресценцию гумусовых веществ (рис. 5) (Синельников, Хмылев, 1987).

Растворы гуминовой кислоты способны снижать яркость флуоресценции других органических соединений, которые присутствуют в воде. При прибавлении 2 мг гуминовой кислоты к исследуемому образцу воды объемом 50 мл и цветностью 60о яркость люминесценции снизилась на 5% от начальной, в то же время цветность возрасла более чем в 3 раза (Синельников, 1966).

45

содержится в открытом море, имеет не континентальное происхождение, а образуется в океане при распаде органического вещества. Аналогично, известный советский гидрохимик Б.А. Скопинцев полагал, что в океанских водах абсолютно преобладает планктоногенный гумус, и лишь в прибрежных водах несколько возрастает доля терригенного гумуса. В морях (особенно гумидной зоны) роль последнего уже более значительна. В водах открытых водоемов суши соотношение обеих форм гумуса различно, но в большинстве случаев преобладает водный гумус терригенной природы (Скопинцев, 1979). По мнению Н. Ерлова (1980) и Г.С. Карабашева (1987, 1999), образование желтого вещества в открытом море можно считать экспериментально доказанным. Например, наличие ЖВ в зоне подъема вод к западу от Южной Америки доказывает его непосредственно морское происхождение, поскольку в этом районе практически отсутствует приток пресной воды в виде стока с суши и осадков (Ерлов, 1980). Исследования флуоресценции морских вод выявили приуроченность максимумов вертикальных распределений свечения РОВ к скоплениям хлорофилла, т.е. фотосинтезирующего фитопланктона (Карабашев, 1999).

Для пресных водоемов А.Д. Семеновым и др. (1974) показана отчетливая связь между общей биомассой фитопланктона и суммарным содержанием РОВ. Наиболее резкие повышения содержания органического углерода наблюдались в периоды массового развития водорослей (Семенов

идр., 1974).

Всоставе органических веществ сточных вод после биологической очистки содержится группа соединений, ярко флуоресцирующих в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (Синельников, 1980).

Таким образом, в желтом веществе подавляющего большинства природных вод содержатся флуоресцирующие соединения. Существует устоявшееся мнение, что ЖВ консервативно, инертно, почти равномерно распределено в однородных водных массах водоемов. С учетом указанных свойств его можно рассматривать как удобный природный индикатор и использовать в гидрологических, гидрооптических, а также гидробиологических исследованиях, поскольку растворенное органическое вещество входит в пищевую цепь бактерий, а содержание ЖВ определяет продукцию бактерий (Апонасенко и др., 1991; Сидько и др., 1995; Сидько и др., 1996; Апонасенко и др., 1997; Апонасенко и др., 1998; Карабашев, 1999;

Кондратьева, 2000; Coble et al., 1990; Mopper, Schultz, 1993).

47

ГЛАВА 3

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследований

Объектами исследований служили природные воды и экспериментальные водные среды. Природные воды – около 80 проб пресных, солоноватых и морских вод – были отобраны из различных водоемов Кольского полуострова (рек, ручьев, озер, эстуариев и др.). Забор проб осуществлялся металлическим батометром объемом 1 л с поверхностного горизонта (глубина 0,5–1 м) в разные сезоны года. Экспериментальные водные среды представляли собой биологизированную в результате жизнедеятельности организмов водопроводную воду, либо минеральные среды, приготовленные на морской или дистиллированной воде, где развивались культуры фотосинтезирующих организмов. В экспериментах анализировали спектры флуоресценции и возбуждения водных сред при условии развития в них различных групп гидробионтов.

Природную воду и культуральные среды перед проведением измерений фильтровали через двойной бумажный фильтр «синяя лента» (Ø пор 1–2,5 мкм) для удаления взвеси клеток водорослей и других организмов, а также крупной органоминеральной взвеси (детрита), если таковая присутствовала. Некоторое количество водорослей и мелких взвешенных веществ, прошедшее через фильтр, не мешало измерениям. Напомним, что взвешенным веществом в природных водах принято считать ту его часть, которая после удаления из воды крупных частиц задерживается фильтром с размерами пор ~ 0,5 мкм (Ларионов, Скопинцев, 1974; Сущеня, 1968; Parsons, Strickland, 1959). Максимальные размеры частиц в морской воде, пропущенной через фильтр с порами ~ 0,5 мкм, составляют 0,2–0,3 мкм (Mullin, 1965). По мнению К.С. Шифрина (1983), то, что называют растворенным органическим веществом, не является молекулярным раствором в точном смысле слова. Как отмечает Е.А. Романкевич, к растворенному веществу в химии океана относят все то, что проходит через фильтры с размером пор 0,45–1 мкм. Сюда входит как истинно молекулярный раствор, так и мелкая взвесь (Романкевич, 1977).

3.2. Регистрация спектров флуоресценции и возбуждения

Для определения спектров флуоресценции и возбуждения водных сред использовали спектрофлуориметр FP-550 фирмы «Jasco» (Япония). Прибор позволяет регистрировать спектры флуоресценции и возбуждения в области 220–750 нм. Для возбуждения флуоресценции в данном приборе

48

используется ксеноновая газоразрядная лампа мощностью 150 Вт с непрерывным спектром излучения в исследуемой нами области (и отдельной спектральной линией 468,5 нм). Погрешность измерения длины волны согласно техническому описанию составляла ±1,5 нм, а воспроизводимость результата ±0,5 нм. При регистрации спектров применяли стандартную (в комплекте с прибором) кювету с плоскопараллельными стенками длиной 10 мм и объемом исследуемой жидкости 3 мл. Длина волны возбуждения флуоресценции составляла 266 нм. Данная длина волны возбуждения при измерениях флуоресценции РОВ ранее не использовалась, хотя в научной литературе содержались косвенные обоснования возможной эффективности применения длин волн порядка 200–300 нм для количественного анализа РОВ

(Иванов, 1975; Ерлов, 1980; Yentsch, Reichert, 1962). Такая длина волны была выбрана также и для того, чтобы в максимальной степени избежать перекрытия области флуоресценции РОВ с полосами излучения Рамана и Рэлея.

Спектры флуоресценции регистрировали на длинах волн 300–520 нм. При этом пик комбинационного рассеяния воды (рассеяние Рамана) приходился на 292 нм, а излучение рэлеевского типа, именуемое «двойным порядком рассеяния дифракционной решетки», соответственно – на 532 нм (см. рис. 8 на стр. 82, 0-е сутки).

Скорость развертки длины волны при регистрации спектров флуоресценции устанавливали равной 50 нм в мин, что при интервале считывания (интегрирования) в 5 сек соответствовало шагу сканирования 4 нм. Данные выдавались на цифровое печатающее устройство DP-101 фирмы «Jasco», комплектующееся со спектрофлуориметром. Затем данные, напечатанные на бумажной ленте, заносили в персональный компьютер. Обработку и визуализацию спектров проводили с использованием стандартного приложения Microsoft Excel for Windows., а статистический анализ данных – с применением прикладного пакета Statistica.

Кроме спектров флуоресценции регистрировали так называемые спектры возбуждения. Спектры возбуждения – это функция распределения излучаемой веществом энергии в зависимости от длины волны (или частоты) возбуждения. В принципе форма спектра возбуждения должна быть идентична форме спектра поглощения молекул и не зависеть от длины волны, на которой измеряют флуоресценцию. Однако это выполняется очень редко. Дело в том, что спектры поглощения и возбуждения могут отличаться из-за различия химических и физических свойств молекул в возбужденном состоянии по сравнению с основным (Левшин, Салецкий, 1994). При анализе сложных растворов, какими являются природные воды, главное отличие спектров будет состоять в том, что не все вещества, которые поглощают свет, будут флуоресцировать. То есть спектр возбуждения будет более избирательным по сравнению со спектром поглощения.

Спектр возбуждения определяли следующим образом: регистрирующий монохроматор спектрофлуориметра устанавливали на длину вол-

49