7.6 Використання генетичної інженерії в тваринництві

Застосування методів генетичної інженерії в тваринництві відкриває перспективу зміни ряду властивостей організму: підвищення продуктивності, резистентності до захворювань, збільшення швидкості росту, покращення якості продукції та ін. Тварин, які несуть в своєму геномі рекомбінантний (чужорідний) ген, прийнято називати трансгенними,а ген, інтегрований в геном реципієнта, - трансгеном.. Продукт цього гену (білок) є трансгенним. Завдяки переносу генів у трансгенних тварин виникають нові якості, а подальша селекція дозволяє закріпити їх в потомстві і утворювати трансгенні лінії.

Одержання трансгенних тварин передбачає ряд етапів: приготування розчину ДНК для мікроін’єкцій; вилучення ембріонів із донорних організмів; мікроін’єкція ДНК і пересадка ін’єкційованих ембріонів в яйцеводи або після культивування в матку синхронізованих реципієнтів. У народжених потомків досліджують експресію трансгену на рівні транскрипції і трансляції. Трансгенне потомство одержують шляхом використання традиційних методів розведення тварин. Слід відмітити, що від приготування ін’єкційного розчину ДНК (його чистоти, концентрації) багато в чому залежить ефективність одержання трансгенних тварин.

Звичайно гени транспортують на ранніх стадіях розвитку тварини (в більшості випадків на стадії зиготи і двоклітинних зародків). Для трансформації генів в геном тварини використовують наступні заходи: мікроін’єкція ДНК в пронуклеус зигот або в кожний бластомір у двоклітинного ембріона; введення ДНК за допомогою ретровірусних векторів; одержання трансгенних химер із генетично трансформованих клітин і ембріонів. В даний час найбільш розповсюджений метод – мікроін’єкція ДНК. Її здійснюють за допомогою спеціальної піпетки (внутрішній діаметр її близько 1мкм), а кількість ін’єкційованого розчину ДНК складає 1-2 пкл. Після ін’єкції ДНК ембріони культивують до моменту пересадки реципієнтам. Слід відмітити, що мікроін’єкція ембріонів сільськогосподарських тварин значно складніша, ніж мікроін’єкція ембріонів мишей і кроликів.

Після невеликого культивування in vitro проін’єкційовані ембріони переносять в яйцеводи (хірургічним шляхом) реципієнтів. Кожному реципієнту миші, кролику і свині звичайно пересаджують 20-30 ін’єційованих зигот, причому у свиней всі ембріони трансплантують в один яйцевод; у мишей і кроликів – окремо по яйцеводах, кіз і великої рогатої худоби – по 2-4 ембріона кожному реципієнту. Використовуючи методи блот-аналізу, дот-блот-аналізу і ПЦР, можна одержати цілком надійні докази інтеграції та експресії ДНК у трансгенних тварин. З цією метою використовують клітини тканин, що містять ядра або внутрішні розчини реципієнта, із яких виділяють ДНК.

Для дослідження у трансгенних тварин виділяють РНК із тих тканин, в яких припускається найбільш високий рівень експресії. Якісний і кількісний аналізи екзогенних білків дозволяють судити про рівень трансляції ін’єційованого генного матеріалу.

Генетичний аналіз народжених трансгенних тварин і одержаного від них потомства показав, що, не дивлячись на ін’єкцію ДНК на ранніх стадіях, в трансгенних лініях можуть появлятися так звані мозаїки. До мозаїк відносять тварин, які походять від однієї зиготи, але які мають різні генотипи. Крім клітинних ліній, що містять трансген, вони мають ще і нетрансгенні клітинні лінії. Підраховано, що близько 30% первинних трансгенних тварин, одержаних методом мікроін’єкції ДНК, - мозаїки, що ускладнює створення чистих трансгенних ліній тварин. Цим пояснюється той факт, що трансген не передається потомству з очікуваною у відповідності із законами Менделя частотою 50%. Частина мозаїки взагалі не може дати початок трансгенним лініям, так як у них відсутня передача трансгену спадково.

Одним із важливих завдань сільськогосподарської біотехнології – виведення трансгенних тварин з поліпшеною продуктивністю і більш високою якістю продукції, резистентністю до хвороб, а також створення так званих тварин-біореакторів - продуцентів цінних біологічно активних речовин. Які ж успіхи біотехнології в цьому напрямку? З генетичної точки зору особливий інтерес становлять гени, кодуючі білки каскаду гормону росту: безпосередньо гормон росту (ГР), рилізинг-фактор гормону росту (РФ) і інсулінподібний фактор ГР (ІФГР).

В кінці 70-х років ХХ ст. на основі технології рекомбінантної ДНК одержали гормон росту мікробного походження. Було показано, що ГР виявляє таку ж стимулюючу дію на лактацію і ріст тварини, як і гіпофізарний ГР. Гормон росту, одержаний за допомогою методів генетичної інженерії, при великомасштабному використанні викликав збільшення надоїв на 23-31% при дозі 13мг в день. Розроблені форми препарату пролонгованої дії, що дозволяють використовувати його один раз в два тижні і далі в місяць. При щоденній ін’єкції ГР молодняку великої рогатої худоби, свиней і овець вдалося збільшити добові прирости на 20-30% при значному скороченні витрат кормів на одиницю приросту. У молодняку свиней з прискоренням росту збільшувався вміст білку і зменшувався вміст жиру в тканинах, що підвищувало якість м’ясопродуктів.

Перші трансгенні миші з геном ГР були одержані в 1982р. У них помічалося підвищення швидкості росту і збільшення кінцевої живої маси. Однак у трансгенних свиней з геном ГР 9(1989) збільшення росту не спостерігалося.

За даними Л.К.Ернста (1996), у трансгенних свиней з геном рилізинг-фактору гормону росту (РФ ГР) кінцеві жива маса була на 15,7% вищою порівняно з контрольними тваринами. У потомстві трансгенних свиней, які одержували модифікований кормовий раціон з підвищеним вмістом білку (18% сирого протеїну) і з додатковою кількістю лізину, відмічалися більш високі середньодобові прирости (на 16,5%).

У трансгенних овець з генами ГР і РФ ГР, не дивлячись на підвищений рівень ГР, швидкість росту не збільшувалась. Разом з тим, за даними більшості дослідників, у трансгенних свиней поряд з підвищеним вмістом білку спостерігалось дворазове зменшення товщини шпику (7-8мм у трансгенних в порівнянні з 18-20мм у контрольних тварин); аналогічні показники відмічались у трансгенних овець (25-30% жиру у контрольних тварин проти 5-7% у трансгенних овець).

Розглядається можливість зменшення лактози в молоці шляхом створення тварин, у яких присутній специфічний для молочної залози промотор, з’єднаний з геном ферменту β-галактозидази, що каталізує розпад лактози. Молоко таких тварин, що не містить лактозу, можуть використовувати люди, у яких не синтезується β-галактозидаза. Ведуться роботи по введенню генних конструкцій в організм трансгенних тварин, які виробляють антитіла, що попереджують мастити.

Інше важливе завдання – виведення трансгенних тварин, стійких до захворювань. Втрати в тваринництві, спричинені різними хворобами, досить великі, тому все більш важливе значення набуває селекція тварин по резистентність до хвороб, викликаних мікроорганізмами, вірусами, паразитами і токсинами. Поки результати селекції на стійкість тварин до різних захворювань невеликі, але надійні. Зокрема, створені популяції великої рогатої худоби з домішкою крові зебу, стійкі до деяких кровопаразитарних захворювань. Встановлено, що захисні механізми від інфекційних захворювань обумовлені або перепоною вторгнення збудника, або зміною рецепторів. Вторгненню збудників, як і їх розмноженню, перешкоджають в основному імунна система організму та експресія генів головного комплексу гістосумісності. Одним із прикладів гену резистентності у мишей служить ген Мх. Цей ген, виявлений в модифікованій формі у всіх видів ссавців, виробляє у Мх⁺ - мишей імунітет до вірусу грипу А. Ген Мх⁺ був виділений, клонований і використаний для одержання трансгенних свиней, що експресують ген Мх на рівні РНК. Однак дані про трансляцію Мх – протеїну, що зумовлює стійкість трансгенних свиней до вірусу грипу А, поки не одержані. Ведуться дослідження з метою одержання трансгенних тварин, резистентних до маститу за рахунок підвищення вмісту білку лактоферину в тканинах молочної залози. На культурі клітин із нирок трансгенних кроликів було показано, що клітинні лінії, які містять трансгенну антизмістовну РНК, мали резистентність проти аденовірусу Н5 (Аd₅) більш високу (на 90-98%) у порівнянні з контрольними лініями клітин. Л.К.Ернст продемонстрував також стійкість трансгенних тварин з геном антизмістовної РНК до лейкозу великої рогатої худоби, до зараження вірусом лейкозу.

Показана можливість конструювання системи внутріклітинної імунізації проти інфекційних вірусів за участю мутаційних форм ендогенних вірусних білків, що захищають від відповідних вірусів. Так, одержані трансгенні кури, стійкі до лейкозу, у яких в клітинах був присутній білок вірусної оболонки.

Трансгенні тварини як продуценти цінних біологічно активних білків і гормонів мають ряд переваг перед мікроорганізмами і клітинними системами. Важливо, що нові білки, одержані в лініях клітин трансгенних тварин, можуть бути модифіковані, їх активність порівняна з активністю протеїнів. Для молочного виробництва представляє великий інтерес одержання цілеспрямованої трансгенної експресії в епітеліальні клітини молочної залози з метою виходу білків з молоком. Одним із основних етапів одержання трансгенних тварин, продукуючих гетерогенний білок з молоком, - ідентифікація промотора, спрямовуючого експресію структурних генів в секреторний епітелій молочної залози.

В даний час виділені гени і промотори aS1 – казеїну, β- казеїну, а –лактоальбуміну і сивороточного кислого протеїну (WAP). Молочна залоза – чудовий продуцент чужорідних білків, які можна одержувати із молока і використовувати в фармацевтичній промисловості. Із молока трансгенних тварин відокремлюють наступні рекомбінантні білки: людський білок С, антигемофільний фактор IХ, а –1 – антитрипсин, тканинний плазмовий активатор, лактоферин, сивороточний альбумін, інтерлейкін – 2, урокиназу і хімозин. В більшості проектів, за виключенням а –1 – антитрипсину і хімозину, ці досліди поки ще на стадії розробки і проводяться в основному на трансгенних мишах, тому оцінювати їх з точки зору комерційного інтересу ще зарано.

Вищесказане можна проілюструвати наступними прикладами. В США здійснено метод мікроін’єкції ДНК, що відповідає за експресію β – лактоглобуліну, який здатний продукуватися тільки в молочних залозах тварин. В Единбурзі в 1992р. були виведені трансгенні вівці з геном а –1- антитрипсину людини і β-глобуліновим промотором. Вміст цього білку у різних трансгенних овець склав від 1 до 35г/л, що відповідає половині всіх білків у молоці. При такому рівні продукції білку може бути одержано близько 10кг трансгенного білку від однієї тварини в рік, що досить для 50 пацієнтів при лікуванні емфіземи легенів. Звичайно вихід рекомбінантних білків в системах з використанням культури клітин складає близько 200 мг/л, а у трансгенних тварин він може підвищуватися до 1л. Слід відмітити, що створення клітинних культур і їх вирощування в промислових реакторах, а також виведення трансгенних тварин і їх обслуговування – дорогі і складні процедури. Однак трансгенні тварини легко розмножуються, утримання їх порівняно дешеве, що робить цих тварин добрими продуцентами різних білків з низькою вартістю. В Росії групою вчених під керівництвом Л.К.Ернста одержані трансгенні вівці з геном хімозину, в 1л молока яких міститься 200-300мг хімозину – основного компоненту для виробництва сиру. Вартість його буде в декілька разів нижчою продукту, який одержуємо традиційним способом із сичугів молочних телят і ягнят. Наведені дані свідчать про високу ефективність виробництва сиру з використанням хімозину молока трансгенних овець. Так, із 3 л молока трансгенної вівці можна одержати достатню кількість хімозину для виробництва 1т сиру із коров’ячого молока.