7.2 Біотехнологія рекомбінантних днк

Технологія рекомбінантних ДНК включає набір як нових методів, так і запозичених із інших дисциплін, зокрема із генетики мікроорганізмів. Ці методи суттєво розширюють можливість генетичних дослідів. Використовуючи технологію рекомбінантних ДНК, одержують навіть мінорні клітинні білки у великих кількостях і проводять тонкі біохімічні дослідження структури і функцій білків, а також здійснюють детальний хімічний аналіз генетичного матеріалу. До найбільш важливих методів біотехнології рекомбінантних ДНК слід віднести наступні:

1. Специфічне розщеплення ДНК рестрикціюючими нуклеазами, що в значній мірі прискорює виділення різних генів і маніпуляції з ними.

2. Швидке секвенування всіх нуклеотидів в очищеному фрагменті ДНК, що дозволяє визначити точні межі гену і кодовану ним амінокислотну послідовність поліпептиду.

3. Гібридизація нуклеїнових кислот, що дозволяє з великою точністю виявити специфічні нуклеотидні послідовності на основі їх здатності зв’язувати компліментарні основи.

4. Клонування ДНК, суть якого зводиться до введення ДНК-фрагменту в генетичний апарат, що самореплікується (плазміду або вірус), який використовують для трансформації бактерій. Бактеріальна клітина після трансформації здатна відновити цей фрагмент у багатьох мільйонах ідентичних копій.

5. Генетична інженерія, що дозволяє одержувати модифіковані версії генів і потім вводити їх в клітини або організми.

Технологія рекомбінантних ДНК здійснила істотний вплив на всю клітинну біологію, дозволяючи вирішувати такі завдання, як визначення будови і функції не тільки білків, але і індивідуальних доменів, а також розшифровувати механізми регуляції експресії генів, одержувати багато білків, які беруть участь в регуляції обмінних процесів, клітинної проліферації та розвитку організму.

Розщеплення ДНК в специфічних ділянках нуклеотидних послідовностей здійснюється особливими ферментами – рестрикціюючими нуклеазами, здатними зруйнувати чужорідну ДНК. Всі ферменти умовно можна розділити на наступні групи:

1. використовували для одержання фрагментів ДНК;

2. синтезуючі фрагменти ДНК на матриці РНК;

3. з’єднуючі фрагменти ДНК;

4. які дозволяють здійснити зміни структури кінців фрагментів ДНК;

5. використовувані для приготування гібридизаційних проб.

Кожен фрагмент, здатний зруйнувати чужорідну ДНК, впізнає в ній специфічну послідовність із 4-6 нуклеотидів. Відповідні послідовності в геномі бактерій замасковані метилуванням залишків за допомогою метилаз.

Згідно номенклатури, запропонованої Х.Смітом і Д.Натансоном, назва рестриктази складається із трьох букв: перша означає родову назву, дві інші – перші букви виду. Наприклад, фермент із Е.coli означає як Eco або із Haemophilus influenzae – Hin і т.д. Типова або штамова ідентифікація йде за родовидовою,

наприклад, EcoRi або Hindll і т.д. В данний час різні фірми випускають більше 100 різних ферментів, які впізнають послідовності нуклеотидів. Для кожного конкретного ферменту вони різняться по довжині, первинній структурі і способу розриву молекули ДНК. Переважна більшість ферментів розриває тільки двониткову ДНК з утворенням серії фрагментів, що звуться рестрикційними (або рестриктами) з тупими або липкими кінцями (рис.13).

Рис.13 Ділянки впізнавання ДНК трьома рестриктазами із Haemophilus parainfluenzae (Hpal); Eschrichia coli (EcoRI) Haemophilus influenzae (HindIII)

Більшість рестриктаз вносять розриви в два ланцюги ДНК із зміщеним на декілька нуклеотидів і утвореним на кінцях фрагментів коротких одно ланцюгових ділянок. Вони здатні утворювати пари основ з любою іншою одноланцюговою ділянкою, одержаною за допомогою того ж ферменту (липкі кінці). Липкі кінці дозволяють легко з’єднувати два будь-яких фрагменти ДНК в одне ціле. Одержаний фрагмент ДНК (будь-якого походження) можна вбудувати в очищену ДНК плазміди або бактеріального вірусу.

Порівняння розмірів фрагментів ДНК після обробки відповідної ділянки геному набором рестриктаз дозволяє побудувати рестрикційну карту, яка відображає розташування певної послідовності нуклеотидів в даній ділянці. Порівнянням таких карт можна оцінити ступінь гомології між окремими генами (ділянками) без визначення їх нуклеотидної послідовності. Рестрикційні карти важливі для клонування ДНК, вирішення еволюційних і філогенетичних завдань.

Для успішного вирішення завдань генетичної інженерії дуже важливо швидко секвенувати (визначити послідовність нуклеотидів) будь-які очищені фрагменти ДНК. В даний час об’єм інформації про послідовності ДНК такий великий, що для зберігання і аналізу даних про фрагменти, цілих геномах необхідні нові технології і комп’ютерна техніка.

Рис.14. Схема отримання родини мічених по S- кінцю фрагментів ДНК в результаті розщеплення по визначеному нуклеотиду (А)

В біотехнології рекомбінантних ДНК зазвичай використовують два різних методи секвенування ДНК: хімічний і ферментативний. Обидва методи надзвичайно надійні, швидкі у виконанні і результативні. Результати секвенування дозволяють також на основі генетичного коду визначити амінокислотну послідовність білка у відповідності з нуклеотидною послідовністю в відповідному гені. На рис.14 показана схема хімічного методу секвенування ДНК. Вихідний фрагмент ДНК, мічений ³²Р по S^/ - кінцю, піддається специфічному розщепленню по визначеному нуклеотиду (наприклад, А), в результаті чого утворюються радіоактивні фрагменти різної довжини, які діляться за розмірами при гель-електрофорезі, а радіоактивні із них виявляються за допомогою радіоавтографії.

Зазвичай, хімічна реакція розщеплення ДНК виконується одночасно для чотирьох однакових проб ДНК з використанням хімічних агентів, які розщеплюють ДНК по окремих нуклеотидах (Т,С,G, А). Одержані зразки піддають електрофорезу на паралельних доріжках одного гелю, і по його результатах можна визначити нуклеотидну послідовність ДНК (рис.15.).

Е нзиматичний метод секвенування заснований на ензиматичному введенні нуклеотиду, що термінує полінуклеотидний ланцюг (рис.16). У цьому випадку зазвичай використовують дідезоксирибонуклеозидтрифосфати, в яких дезоксирибоза – 3 ^/ - ОН, представлена в нормальних нуклеотидах, відсутня. Такий модифікований нуклеотид, поглиблюючись в ланцюг ДНК за допомогою ДНК–полімерази, блокує приєднання наступного нуклеотиду. Синтез in vitro молекули ДНК в присутності затравки (праймера) і невеликої кількості одного із таких модифікованих нуклеотидів призводить до утворення фрагментів ДНК у вигляді «драбини». Якщо для одержання таких фрагментів застосовувати мічену ДНК (зазвичай проводять чотири реакції синтезу з використанням різних нуклеотидів, що термінують ланцюг), а електрофоретичний аналіз проводять на чотирьох доріжках гелю, то можна визначити послідовність нуклеотидів. В данний час використовують модифікований метод, що приводить до флуоресцентного аналізу наборів фрагментів ДНК в процесі руху по одній доріжці гелю.

Рис.15. Схема електрофореграми, яка була отримана за допомогою хімічного метода секвенування ДНК (перший знизу рядок відповідає нуклеотиду на 5^/- кінці і є нуклеотидом Т на рівні першої доріжки). Для визначення повної послідовності (відмічено пунктиром) проводять аналіз пошарово всіх доріжок.

Найважливіший метод одержання рекомбінантних ДНК заснований на здібності нуклеїнових кислот швидко відновлювати свою структуру після нагрівання до 100^оС в сильно лужному середовищі (рН 13). При нагріванні до 100^оС комплементарні пари основ руйнуються і ДНК дисоціює на два окремі ланцюги. Цей процес названий денатурацією ДНК («плавлення»). Витримка комплементарних ланцюгів при температурі 65^оС призводить до їх спарювання і відновленню структури подвійної спіралі (гібридизація, ренатурація, або «віджиг»). Цю властивість ДНК широко використовують в хімічній систематиці,

а також для вирішення еволюційних і ф ілогенетичних проблем.

Рис.16. Схема ензиматичного методу секвенування нуклеїнових кислот, заснованого на ензиматичному введені нуклеотида, який термінує ланцюг:

А – синтез in vitro в присутності затравки з утворенням «драбини» фрагментів; В – інкубація чотирьох різно пофарбованих флуоресціюючих затравок у суміш нуклеотидів з добавкою різних дідНТФ, які зупиняють ріст ланцюга (A,T,C,G).

Швидкість відновлення (ренатурації) подвійної спіралі залежить від ймовірності зіткнення двох комплементарних нуклеотидних послідовностей і їх концентрації в розчині. Швидкість реакції гібридизації можна використовувати для визначення концентрації будь-яких послідовностей РНК або ДНК в суміші, яка має й інші фрагменти нуклеїнових кислот. Для цього необхідно мати чистий одноланцюговий фрагмент ДНК, комплементарний до того фрагмента, який треба виявити. Зазвичай фрагмент ДНК, одержаний клонуванням або хімічним шляхом, мітять по ³²Р з метою прослідковувати за включенням фрагменту в склад дуплексів при гібридизації.

Одноланцюгову молекулу ДНК, що використовується в даному методі в якості міченого індикатора, називають ДНК-зондом. Розміри його коливаються від декількох десятків до декількох сотень і тисяч нуклеотидів. Реакція гібридизації з використанням ДНК-зондів дозволяє ідентифікувати нуклеотидні послідовності в дуже низькій концентрації і тим самим визначити, яка кількість копій послідовності ДНК, комплементарної ДНК-зонду, присутня в геномі клітини.

ДНК-зонди застосовують для пошуку споріднених генів; в реакціях гібридизації з РНК – для виявлення експресії даного гену в різних клітинах. Для виявлення молекул нуклеїнових кислот, комплементарних всьому зонду (або його ділянці), ДНК-зонди часто з’єднують з методом гель-електрофорезу, що дозволяє одержувати інформацію про розміри молекул ДНК, які гібридизуються. Ефективність використання сучасних приладів, здатних автоматично синтезувати будь-які нуклеотидні послідовності за короткий проміжок часу, дало можливість перебудувати гени, що представляють собою один із важливих аспектів генної інженерії. Обмін генами, а також введення в клітину гену іншого виду організму здійснюють шляхом генетичної рекомбінації in vitro. Цей підхід був розроблений на бактеріях, зокрема на Е.coli. Він заснований на властивостях ДНК – здатності до перебудов, що змінюють комбінацію генів в геномі, і їх експресію. Така унікальна здатність ДНК дозволяє пристосовуватися даному виду до зміни середовища. Генетичну рекомбінацію поділяють на два великі класи: загальну рекомбінацію і сайт-специфічну рекомбінацію. В процесі загальної рекомбінації генетичний обмін в ДНК проходить між гомологічними нуклеотидними послідовностями, наприклад між двома копіями однієї і тієї ж хромосоми в процесі мейозу (кроссинговера), або при схрещуванні і перегрупуванні генів у бактерії.

В процесі сайт-специфічної рекомбінації в обмін вступають специфічні нуклеотидні послідовності однієї і тієї ж або обох спіралей ДНК, що розпізнаються особливим сайт-специфічним ферментом, що призводить до трансформації перерозподілу нуклеотидних послідовностей в геномі. Будь-які комплементарні взаємодії між двома гомологічними спіралями ДНК можливі лише тоді, коли в одному із двох ланцюгів відбувається розрив. До числа факторів, які викликають такі одно ланцюгові розриви, відносять: хімічні агенти, деякі види випромінювання, специфічні білки. Наприклад, у Е.coli знайдений білок rec BCD, який викликає в молекулах ДНК одноланцюгові розриви. Білок rec BCD являє собою ДНК-залежну АТРазу, яка діє як ДНК-хеліказа, що переміщається по спіралі ДНК і викликає її розплетіння. Під впливом цього білку, що володіє нуклеазною і хеліказною активністю, на подвійній спіралі ДНК виникає розрив з утворенням одноланцюгової ділянки «вус» (whisker) (рис17).

Рис.17. Схема процесу загальної рекомбінації за участю білку rec BCD у Е.coli:

А – подвійна спіраль ДНК; Б- приєднання до подвійної спіралі білка rec BCD з послідуючим його переміщенням; В – виникнення розриву в сайті впізнавання; Г- утворення одноланцюгової ділянки «вус».

Білок rec BCD приєднується до подвійної спіралі ДНК з одного кінця (5^/) і з швидкістю близько 300 нуклеотидів в секунду рухається вздовж спіралі ДНК за рахунок гідролізу АТР. Одночасно з білком рухається і петля ДНК, що виникла. Коли петля на спіралі досягає ділянки, названої сайтом впізнавання (recognition site), один із ланцюгів розривається з вивільненням невеликої одноланцюгової ділянки «вус». «Вус», що виник, ініціює подальшу генетичну рекомбінацію.

В процесі загальної генетичної рекомбінації центральна роль відводиться комплементарним взаємодіям нуклеотидних послідовностей. Крім того, цей

процес потребує участі особливого білка recA з Mr, рівній 38 кДа. Білок recA міцно зв’язується в вигляді великих кластерів з одинокими ланцюгами ДНК, одночасно утримуючи і подвійну спіраль. За рахунок двох сайтів даний білок має ще одну ділянку – для зв’язування і гідролізу АТР, тобто він являє собою ДНК – залежну АТРазу. Завдяки особливостей білку recA здійснюється одноланцюговий обмін між двома подвійними спіралями (рис.18) з вилученням деякої кількості нуклеотидів і локальний ресинтез ДНК.

Рис.18. Схема початкового одноланцюгового обміну між двома гомологічними подвійними спіралями ДНК в процесі загальної рекомбінації.

Розрив в одному із ланцюгів ДНК визволяє цей ланцюг, і він поглиблюється в другу спіраль, утворюючи коротку спарену ділянку. Після початкового обміну гомологічні нуклеотидні послідовності двох взаємодіючих спіралей встановлюються в суворій відповідності одна до одної, в зв’язку з чим проходить розширення області спарювання і швидкий обмін між спіралями. Для цього процесу різні організми використовують неоднакові механізми, більшість із яких включає в якості проміжного етапу обмін з перетину ланцюгів між двома спіралями ДНК (рис.19).

С труктура, що утворюється при обміні з перехрещенням ланцюгів, містить два перехрещені та два не перехрещені ланцюги. Вона здатна існувати в різних ізомерних формах. Ізомеризація змінює положення двох пар ланцюгів: два ланцюги, які раніше перехрещувались стають неперехрещеними і навпаки.

Для того, щоб відновились дві окремі спіралі ДНК і тим самим припинився процес спарювання, в кожному з двох перехрещених ланцюгів повинен відбутись розрив (рис.20).

Рис.19. Схема утворення структури з перехрещуванням ланцюгів між двома спіралями ДНК.

Рис.20. Схема генетичного обміну між двома гомологічними спіралями ДНК без кроссинговера.

У випадку ізомеризації одного із ланцюгів (поворот на 180^о) розрив перехрещених ланцюгів дає кроссовірні хромосоми (рис.21).

Рис.21. Схема утворення молекули ДНК після ізомеризації перехрещених ланцюгів і кроссинговера.