7.3 Конструювання рекомбінантної днк

Сутність генетичної інженерії зводиться до цілеспрямованого конструювання генетичних систем поза організму з послідуючим введенням їх в живий організм. При цьому рекомбінантні ДНК стають складовою частиною генетичного апарату реципієнтного організму і, крім того, вони доповнюють його новими генетичними і фізіолого-біохімічними властивостями, корисними для людини. До числа таких властивостей можна віднести синтез амінокислот і білків, гормонів, ферментів, вітамінів та ін.

Одним із важливих етапів молекули ДНК є лігірування (або зшивання) генів за допомогою ферменту ДНК – лігази. Зшивання фрагментів ДНК, що містить потрібні гени, здійснюють двома основними методами: а) по «липких» кінцях; б) за допомогою штучно добудованих «липких» кінців.

Зшивання генів (фрагментів) ДНК по «липких» кінцях, тобто взаємно комплементарних ділянках довжиною із 4-6 пар нуклеотидів, досить легко здійснювати ферментом ДНК-лігазою з утворенням ковалентного фосфодіефірного зв’язку між сусідніми нуклеотидами:

– – А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц – – – – – –

Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г – – – – – –

Зшивання ДНК-лігаза

А Т Г Ц А А Т Т – Ц А Г Т Ц

Т А Ц Г – Т Т А А – Г Т Ц А Г

При відсутності комплементарних «липких» кінців у фрагментах, які зшиваються, їх добудовують, тобто синтезують штучно ферментативним шляхом. Для цієї мети застосовують так звані лінкери (або «перехідники») – короткі ділянки ДНК, які мають різні «липкі» кінці:

– А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г

Т А Ц Г Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц

Фрагмент 1 Лінкер Фрагмент 2

Лінкерні фрагменти не тільки забезпечують об’єднання генів, але і обумовлюють їх експрессію, в зв’язку з чим часто всередину лінкера вміщують будь-який регуляторний генетичний елемент, наприклад промотор, або ділянку зв’язування з рибосомою.

Можливе зшивання фрагментів і по тупих кінцях, коли кінці фрагментів двохниткові:

– – – А Т Г Ц Г Г Г Ц Ц Ц Г Т А Ц – – – – – –

– – – Т А Ц Г Ц Ц Ц Г Г Г Ц А Т Г – – – – – –

В цьому випадку реакція лігірування має біохімічні особливості і її ефективність нижча, ніж при зшиванні по «липких» кінцях.

Після того, як рекомбінантна ДНК зшита, її вводять в живі клітини. Але оскільки вона не здатна до самовідтворення, її руйнують внутріклітинні нуклеази. Для того, щоб рекомбінантна ДНК стала складовою частиною генетичного апарату клітини, вона повинна або вбудуватися (інтегруватися) в її геном і реплікуватися за його рахунок, або бути здатною до автономної реплікації. Прийнято молекули ДНК, здатні акцептувати чужорідну ДНК і автономно реплікуватися, називати векторними молекулами. До числа векторів відносять плазміни, бактеріофаги, віруси тварин. Вектори повинні мати наступні особливості:

1. Мати субстратні ділянки для визначених ендонуклеаз рестрикції.

2. Мати властивості реплікона.

3. Мати один або декілька маркерних генів, які після проникнення вектора в клітину надають їй фенотип, який свідчить про наявність вектора.

Зокрема, для бактеріальних векторів в якості маркерних генів частіше всього використовуються гени, які визивають стійкість клітин до деяких антибіотиків.

Таким чином, всі вектори забезпечують реплікацію вбудованих генів, їх експрессію, інтеграцію в хромосому клітини і т.д.

Частіше від інших в генетичній інженерії в якості векторів використовують плазміди. Плазмідами називають бактеріальні реплікони (позахромосомні елементи спадковості), які стабільно успадковуються. Вони представляють собою двохланцюгові кільцеві молекули ДНК з варіабельними молекулярними масами. По розміру вони відповідають 1 – 3% генома бактеріальної клітини. Так, молекулярна маса однієї з найдрібніших плазмід, знайдених у E. Coli, складає 1,5 МДа, а клітини псевдомонад містять плазміди з Mr близько 300 МДа, що складає 15% від Mr хромосом цих бактерій. Плазміди поділяють на кон’югативні, які здатні самі перенестись у реципієнтні клітини за допомогою кон’югації, і некон’югативні, які не володіють цими властивостями. Вони детермінують різні властивості: резистентність до антибіотиків (R-плазміди); біодеградацію (D-плазміди) і інші. Наприклад, плaзміди стафілококів несуть гени стійкості до пеніциліну, з’єднанням ртуті та інше. Гени стійкості до важких металів виявлені також у складі R-плазмід E. сoli. Плазміди можуть керувати синтезом інсектецида в клітинах Bacillus thuringiensis F-плазміда E. сoli або FР-плазміди псевдомонад являються статевими факторами. Плазміда pS101 з Mr 5,8 МДа несе ген стійкості до тетрацикліну (селективний маркер). У різних мікроорганізмах – E. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces-виявлені Col-плазміди, які забезпечують синтез різних коліцинів – високоспецифічних антибіотиків, які подавляють життєдіяльність інших штамів мікроорганізмів того ж виду або ж близького виду. Кількість плазмід в клітині може коливатися від однієї до ста. В цілому чим крупніша плазміда, тим менша кількість її копій в клітині.

Перший плазмідний вектор був отриманий С.Коеном (1973). Його джерелом була плазміда E. coli R_6—5 з Mr 65 кДа. Плазміда стала родоначальником серії векторів та інших структур. Особливе місце в генетичному маніпулюванні займає плазміда, яка відноситься до групи коліциногенних плазмід E. coli. Co1E1 реплікуюється, незважаючи на хромосоми і присутній в кількості приблизно 24 копії на клітину. Її широко використовують завдяки селективному маркеру в якості вектора для клонування фрагментів про- і еукаріотичної ДНК в E. coli.

Плазміда Co1E1 (Mr 4,2 МДа) застосовується для клонування EcoRI-фрагментів. При цьому інтеграція чужорідного фрагмента у ділянку впізнавання EcoRI веде до фенотипічної зміни клітини, припинення синтезу коліцина із збереженням імунності до нього. Цю ознаку використовують при відборі рекомбінантних трансформантів.

Плазміда pBR313 містить унікальні ділянки розщеплень декількох рестриктаз: EcoRI, HindIII, BamHI, SaII, XmaI та HpaI. Конструюючи рекомбінантну ДНК, в ці ділянки можна вбудовувати фрагменти чужорідної ДНК, отримані за допомогою відповідних рестриктаз.

Н а рис.22 зображена схема розміщення генів в плазміді pBR322. Плазміда pBR322 містить два гени, які програмують стійкість до двох різних антибіотиків – тетрацикліну (ген tet) та ампіциліну (ген bla). У гені tet знаходяться унікальні ділянки розщеплення рестриктазами HindIII, BamHI і SaII, а в гені bla – ділянка розщеплення PstI. Якщо розрізати плазміду будь-якою із рестриктаз, ділянка розщеплення ,яка знаходиться в гені tet, і з’єднати її методом “липких” кінців з чужорідним фрагментом ДНК, то в отриманій рекомбінантній молекулі залишиться недоторканими тільки ген bla, a ген tet втрачає свою активність, так як його цілісність порушується вставкою. Навпаки, при розрізанні плазміди рестриктазою PstI і вміщення в цю ділянку фрагмента ДНК інактивується ген bla, тоді як ген tet продовжує кодувати білок , який забезпечує стійкість E. coli до тетрацикліну.

Мал. 5.10. Схема будови плазміди pBR322

Плазмідні вектори на даний час надзвичайно різноманітні за рахунок наступних властивостей:

зменшення розмірів плазміди внаслідок вилучення ділянок, не обов’язкових для реплікації (чим більше плазміда містить унікальних ділянок упізнавання для рестриктаз, тим вона універсальніша);

гібридизації векторів одного роді з іншими векторами чи природними плазмідами (наприклад, отримані гібридні вектори) комбінацією плазміди і фагу λ (при якому знову сконструйована рекомбінантна ДНК повинна зберегти реплікаційні властивості вихідної плазміди);

використання нових плазмід;

застосування транспозонів;

створення векторів з генетичними маркерами, які дозволяють вести відбір рекомбінантних клонів.

Еукаріотичні віруси до цих пір знайшли більш скромне застосування в якості векторів. Практично використовуються тільки онкогенний вірус SV 40 і його похідні. Всі ці вектори – дефектні віруси, не здатні давати повноцінні вірусні частки в клітині хазяїна. Вказану ДНК можна вводити і в інші реплікони, здатні розмножуватися в клітинах, наприклад бактеріофаги. Частіше всього із відомих фагів в якості векторів застосовують сконструйовані похідні фага λ і фагів М13 і fd. У векторах на основі бактеріофагу λ використовується його особливість, яка полягає в тому, що більша частина його ДНК не бере участі в розмноженні фага в клітині. Це дозволяє вводити чужорідну ДНК в ДНК фагу λ в якості вектора.

Фаг М13 – це одноланцюгова циклічна ДНК довжиною близько 6500 нуклеотидів. Після інфікування бактеріальної клітини одноланцюгова ДНК фагу перетворюється в дволанцюгову реплікативну форму (RF), яка подібна плазміді. Фагова ДНК має, крім того, коротку ділянку із 500 нуклеотидів, так званий МП (міжгенна послідовність), не важливий для її життєдіяльності. Якраз в цю ділянку МП реплікативної форми ДНК після розщеплення її з допомогою лігази вставляють чужорідну ДНК. Введення рекомбінантної дволанцюгової молекули в клітину Е.coli призводить до її реплікації, синтезу (+) ланцюга, упакування останньої в білковий чохол і виділення фагу в середовище. Інфікована ниткоподібним фагом клітина продовжує ділитися, виділяючи в навколишнє середовище велику кількість фагу. Цей фаг містить у віріоні одноланцюгову циклічну ДНК, в яку вбудована один із ланцюгів чужорідної ДНК.

Векторні плазміди і векторні віруси з вбудованими чужорідними генами часто називають гібридними (або химерними) плазмідами (або фагами). Після конструювання рекомбінантних ДНК за допомогою трансформації вводять в реципієнтний організм: бактеріальну, грибну, рослинну або тваринну клітину. Трансформація передбачає попередню обробку клітин з’єднаннями, що зумовлюють проникнення ДНК всередину клітин з послідуючим їх розміщенням у середовище, в якому здатні існувати тільки клітини, які одержали векторну молекулу, наприклад в середовище з певним антибіотиком.

Процес інфікування клітин за допомогою чужорідних ДНК, який призводить до утворення зрілого фагового потомства, названий трансфекцією.

Практично загальний спосіб трансформації і трансфеції заснований на тому, що при обробці клітин бактерій CaCl₂ їх мембрана стає проникною для ДНК. Однак ефективність проникнення екзогенної ДНК в клітину досить низька. Тому серед бактерій, які піддалися трансформації, тільки невелика частина виявляється трансформованою. Відділення її від загальної маси здійснюється в процесі клонування. Для клонування бактеріальну суспензію певної концентрації виливають на тверде поживне середовище, наприклад на агар з поживними добавками в чашці Петрі із розрахунку 5-10 бактерій на 1см² поверхні. Бактеріальна клітина на поверхні агару починає ділитися з утворенням в результаті маленької колонії, схожої на шляпку гриба. Ця колонія називається клоном, притому із кожної клітини утворюється свій клон, всі клітини якого мають властивості бактерії-родоначальника.

Відбір бактерій-трансформантів можна продемонструвати, використовуючи плазміду pBR322 (див.рис.22), що містить два гени стійких до тетрацикліну і ампіциліну. Для відбору цих бактерій в агар добавляють антибіотик – або ампіцилін, або тетрациклін в залежності від того, який із генів (bla або tet) залишився інтактним після введення чужорідної ДНК. На такому середовищі клони утворюють клітини тільки з плазмідами. Для відокремлення рекомбінантних бактерій частину матеріалу кожного клону переносять на іншу чашку Петрі, що містить антибіотик, ген стійкості до якого був зруйнований при створенні рекомбінантів. На цих чашках Петрі дають клони тільки ті бактерії, які містять вихідну плазміду, а рекомбінантні бактерії їх не утворюють. Така ретельна селекція клонів по стійкості до антибіотика дозволяє ідентифікувати рекомбінантні клони. При пошуку рекомбінантних клонів успішно застосовують метод авторадіографії.

Рекомбінантні клони можуть бути ідентифіковані і по продукту, який вони синтезують. Але частіше доводиться ідентифікувати безпосередньо нуклеотидну вставку з використанням методів гібридизації. З цією метою бактеріальні колонії вирощують на нітроцелюлозних фільтрах, поміщених на чашку Петрі з поживним середовищем. Далі готують репліки: до фільтру з вихідними колоніями притискають свіжий нітроцелюлозний фільтр, який потім переносять на чашку Петрі з щільним поживним середовищем, де утворюються колонії, ідентичні першим.

Потім фільтр-репліку піддають лужній обробці, при якій клітини в колоніях лізують і денатурована ДНК із клітин зв’язується з нітроцелюлозою в тій ділянці, де була розміщена відповідна колонія. При радіоактивній ДНК або РНК (міченій ³²Р або ¹²⁵J) витримка фільтру в розчині, який містить радіоактивний полінуклеотид, призводить до гібридизації з комплементарними послідовностями. В підсумку ті ділянки фільтру, в яких знаходились рекомбінантні клони з потрібною вставкою, виявляються радіоактивними та ідентифікуються радіоавтографічно.