7.4 Експресія чужорідних генів

Ефективність функціонування бактеріальних генів неоднакова, що зумовлює варіабельність концентрації окремих білків в залежності від їх функцій. Такі варіації білків, наприклад у Е.coli, зумовлені системою контролю генної експресії, здійсненої в основному на рівні транскрипції ДНК, і залежать від кількості синтезованої на даному гені мPHK і активності ферменту PHK – полімерази. Порядок в чергуванні нуклеотидних послідовностей в промоторній ділянці структурного гену визначає ступінь активності PHK – полімерази та ініціацію процесу транскрипції. Бактеріальні гени, включені в геном, як правило експресуються досить легко, даючи мPHK і білок в силу того, що в сигнальних послідовностях,що керують процесами транскрипції і трансляції у різних прокаріотичних організмів, багато загальних рис. Що стосується експресії генів еукаріот в бактеріях, то вона буває дуже рідко, якщо не створювати спеціальні умови, оскільки регуляторні ділянки еукаріот відмінні від таких у бактерій. Регуляторні (сигнальні) ділянки не впізнаються бактеріальними PHK – полімеразами, що призводить до уповільнення транскрипції. При клонуванні геномної ДНК еукаріотичної клітини експресія генів не відбувається через відсутність у бактерій системи сплайсингу. Відповідно, для експресії еукаріотичних генів в клітинах прокаріот необхідно, щоб дані гени знаходились під контролем прокаріотичних регуляторних елементів. В зв’язку з цим для здійснення експресії еукаріотичного гену відповідна до ДНК (або синтетична ДНК), яка містить кодовану послідовність, в склад векторної молекули (наприклад, плазміди) приєднується до регуляторних елементів бактерії – промотора, оператору і рибосом – з’єднуючих ділянок.

Таким чином, в сконструйованих проміжних рекомбінантних ДНК еукаріотичний ген буде знаходитися під контролем бактеріальних регуляторних елементів. Доцільніше вбудовувати ген в підходящий вектор для експресії, який уже містить регуляторні елементи, що сприяють активній експресії вбудованого гену після введення рекомбінантної плазміди в бактеріальну клітину. Наприклад, до таких ефективних регуляторних ділянок належить промотор гену β-лактамази (ген стійкості до ампіциліну, що входить до складу плазміди p BR322). Промотор гену β-лактамази нерегульований, а використання таких промоторів не завжди зручно, так як синтезовані білки в більшій кількості можуть блокувати ріст бактерій. В зв’язку з цим доцільніше використовувати регульовані сильні промотори, включити які для синтезу чужорідного білку можна і в тому випадку, коли отримана велика бактеріальна маса. Зокрема, до числа регульованих сильних промоторів слід віднести термочутливий промотор pL, який відповідає за експресію деяких генів бактеріофагу. Білок-репресор, блокуючий даний промотор, активний при 31^оС, але неактивний при 38^оС, відповідно, при інкубуванні бактерій при 31^оС чужорідний ген не експресується і, навпаки, підвищення температури викликає інактивацію репресору і високий рівень синтезу потрібного білку.

Послідовність основ довжиною 6-8 нуклеотидів, розташована безпосередньо перед ініційованим кодоном АУГ у Е.coli, визначає ефективність процесу трансляції. Ця послідовність представляє собою ділянку зв’язування мPHK з рибосомою, і його зсув в ту чи іншу сторону здатен зменшити ефективність трансляції мPHK. По імені дослідників, які ідентифікували цю ділянку, він був названий послідовністю Шайн-Дальгарно. Зазвичай, цю послідовність включають в склад самого вектора разом з ініційованим кодоном на потрібній відстані. При експресії векторів такого типу утворюється гібридний білок, в якому декілька N-кінцевих амінокислотних залишків походять від джерела регуляторних елементів та ініціюючого кодону прокаріотичного гену. Такі гібридні білки часто більш стабільні; обробка їх хімічним або ферментативним способом призводить до виділення еукаріотичної частини білку.

Сумарна активність гену, що експресується, зростає з ростом числа копій рекомбінантної ДНК в розрахуну на клітину. Використовуючи багатокопійні плазміди, можна одержати зверхсинтез потрібних білкових продуктів. Одержані температурно-чутливі мутанти плазміди, здатні накопичувати до 1-2 тис. копій на клітину без порушення життєво важливих функцій бактерій. Зазвичай, використовувані плазмідні вектори підтримуються в клітині в кількості 20-50 копій. Одержання бактеріальних штамів – зверхпродуцентів плазмідних генів – одна з важливих завдань сучасної біотехнології в економічному, медичному і соціальному аспектах.