Контрольные вопросы

1. Раскройте понятие «углеводородокисляющие микроорганизмы».

2. За счёт сего происходит окисление углеводородов микроорганизмами?

3. От каких факторов зависит численность углеводородокисляющих микроорганизмов в водоёме?

4. Приведите примеры углеводородокисляющих микроорганизмов.

5. Для чего в среду для выращивания микроорганизмов добавляют дизельное топливо?

6. Каким методом определяют численность углеводородокисляющих микроорганизмов? Опишите этот метод.

Лабораторная работа №2 Эвтрофные и олиготрофные бактерии, как основные группы гетеротрофного бактериопланктона

Цель работы: определить количественный и качественный состав эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов в воде морских (и/или пресных) водоёмов.

В основе круговорота элементов лежит органическое вещество, поэтому в водоемах доминируют гетеротрофные микробные сообщества, использующие в качестве источника энергии и конструктивного матери­ала органические соединения углерода.

В 1967 г. в экспериментах со штаммами морских гетеротрофных бактерий в хемостате было показано, что по способности к росту при различных концентрациях органических субстратов эти микроор­ганизмы можно разделить на две группы, одна из которых обладает способностью к росту при очень низком содержании субстрата в среде, а вторая - при высоком. При этом микроорганизмы второй группы не проявляли активности, но и не погибали при низких концентрациях органических субстратов в среде. Первая группа бакте­рий в получила название олигокарбофильных, а позднее - олиготрофных бактерий, вторая до сих пор разными исследователями именуется по разному - эвтрофными, сапрофитными, сапротрофными или копиотрофными бактериями.

Бактерии, существование которых в природе зависит от их способности размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода - до 0,1 мг/л в день, относятся к олиготрофам (греч. oligos - малый, trophe - пища). Организмы, не только способные расти на богатых питательных средах, но и предпочитающие изобилие пищевых веществ, относят к копиотрофам (греч. copiosus - изобилие, trophe - пища).

Олиготрофные виды встречаются среди представителей многих родов бактерий, их можно классифицировать в зависимости от особенностей отношения к органическому субстрату:

Характеристика:	Организмы:
Растут на органической среде только в первом посеве пробы, не выдерживают пересевов	Бактерии необычной морфологии: бобовидные, тороидальные, треугольные, шестиугольные, звездчатые клетки и т.п.
При первом посеве пробы растут только на бедных средах, но в последующих пересевах растут на богатых средах	Pseudomonas, Agrobacterium, Pho-tobacterium, Vibrio, Aeromonas, Flavobacterium, Micrococcus, Staphylo-coccus, Corynebacterium, Arthrobacter
Бактерии выделяют и культивируют на специальных бедных средах	Hyphomicrobium, Caulobacter, Mic-rocyclus, Leptothrix, Ochrobium, Metallogenium
Не культивируются в лабораторных условиях. Обнаружены в природных водоемах при изучении проб в электронном микроскопе	Простековые бактерии; некоторые бактерии с газовыми вакуолями

Олиготрофные бактерии являются типичными обитателями водоемов и почв. Многие олиготрофы обладают необычной морфологией, весьма сложным циклом развития и дифференцировкой клеток. Нередко олиготрофные бактерии снабжены простеками - окруженными клеточной стенкой выростами клетки. Такие бактерии называют простекобактериями.

Поскольку репродуктивный ответ олиготрофов на появление пищевых субстратов происходит медленнее, чем у эвтрофов, в условиях непрерывного пищевого потока, популяции эвтрофов используют запасы пищи, быстро размножаются и численно доминируют над олиготрофами. Однако если период поступления пищи был короче цикла репродукции эвтрофов, олиготрофы за счет использования накопленных пищевых резервов получают преимущество и начинают доминировать в истощенной среде. Олиготрофы весьма широко распространены в природе и во многих случаях численно доминируют над эвтрофовными бактериями.

Типичными представителями эвтрофных бактерий являются Е. coli и многие другие хорошо изученные гетеротрофные бактерии. Жизнеспособные клетки эвтрофных бактерий обычно легко можно обнаружить в олиготрофных местах обитания, где их устойчивое существование невозможно. В условиях голодания или при отсутствии достаточного количества пищи такие бактерии в течение некоторого времени сохраняют жизнеспособность. В отсутствие роста может продолжаться их деление и в результате образуются мелкие клетки, обозначаемые в литературе как «ультрамикробактери», «ультрамикроклетки», «минибактерии», «карлики». Через 12-24 ч после прикрепления к поверхности, ультрамикроклетки принимают форму и достигают размеров нормальной бактерии. Среди морских бактерий, образовывавших ультрамикроклетки, обнаружены представители родов Aeromonas, Alcaligenes, Fluvobacterium, Pseudomonas, Vibrio.

Микроорганизмы, приспособленные к жизни в олиготрофных местообитаниях, характеризуются высоким отношением поверхности к объему, способностью к образованию запасных веществ при избыточ­ном, а у некоторых даже при недостаточном поступлении субстрата; низкими тратами на поддержание, что позволяет переживать условия голодания и конкурировать с другими микроорганизмами при низких скоростях роста; наличием системы переносчиков, высокоспецифичных к определенным субстратам; специфической конститутивной системой метаболизма. Полный набор данных свойств обычно не встречается у какого-либо одного организма, но все они являются характерными для микроорганизмов, приспособленных к жизни в олиготрофных место­обитаниях. Показано, что олиготрофные бактерии способны усваивать гораздо более широкий спектр органических субстратов, чем эвтроф­ные, они более гибки в трофическом отношении.

Соответственно различаются и среды, предназначенные для учета олиготрофных и эвтрофных бактерий. Для выделения первых исполь­зуются питательные среды, содержащие от менее 1 мг до 50 мг органического вещества в литре. Четких границ между группами эвтрофных и олиготрофных бактерий, основываясь только на их способности к росту на средах с высоким или низким содержанием сложных органических веществ (пептона, дрож­жевого экстракта и т.д.), провести, по-видимому, невозможно. Считается деление на эвтрофных и олиготрофных бакте­рий вполне оправданным, поскольку раздельный учет численности бак­терий обеих групп позволяет получить дополнительную информацию, например - о трофности водоема.

Таким образом, соотношение численности эвтрофных и олиготроф­ных бактерий имеет важное практическое значение для характеристики состояния водоемов.

Задание:

• нарисовать схему посева для количественного определения эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов;

• определить количество вышеперечисленных микроорганизмов в 1 мл морской и/или пресной воде;

• выделить чистые культуры эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов;

Материалы и оборудование: соли NaCl, MgSО₄x7Н₂О, КС1, К₂НРО₄, Na₂HPО₄, NH₄NО₃, КН₂РО₄х3Н₂О, FeSО₄x7Н₂О, рыбный бульон (РБ), дрожжевой экстракт, пептон, пробирки, стерильные градуированные пипетки на 1 мл; пинцеты, стерильные шпатели, микроскопы и все необходимое для приготовления окрашенных пре­паратов и микроскопирования.

Методика проведения работы:

1. Определение численности эвтрофных и олиготрофных микроорганизмов

Для учета численности эвтрофных бактерий в морских водах наибо­лее часто используется модифицированная среда Зобелла следу­ющего состава (г): пептон - 5,0; КН₂РО₄х3Н₂0 - 0,084; FeS0₄x7Н₂О - 0,185; NaCl - 24,0; MgSO₄х7Н₂О-1,0; КС1-0,7; дрожжевой экстракт -1,0; вода дистиллированная ^_ 1 л. Соленость среды при необходимости может быть понижена за счет уменьшения содержания в среде NaCl. Эту же среду можно использо­вать для учета эвтрофных бактерий в пресных водоемах, исключив из ее состава NaCl. Так же для учета численности эвтрофных бактерий в морских водах может быть использована среда – рыбный бульон.

Для учета олиготрофных бактерий может быть рекомендована моди­фицированная среда ММС следующего состава (г): NaCl - 7,0; MgSO₄х7Н₂О - 1,0; КС1-0,7; К₇НРО₄-2,0; Na₂HPО₄-3,0; NH₄NО₃ - 1,0; вода дистиллированная - 1,0 л. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют 50 мг/л дрожжевого экстракта.

Наиболее распространенным методом учета численности эвтрофных и олиготрофных бактерий, способных к росту на питательных средах, является метод предельных разведений. См. лабораторную работу №1.

Время инкубации проб воды зависит от состава среды и исходной численности микроорганизмов в пробе воды. Как правило, для эвтрофных бактерий время инкубации составляет не более 7 суток, а для олиготрофных бактерий может достигать 1 месяц. Пробирки с разведениями инкубируют при комнатной температуре, желательно не выше 20⁰С. В зимний период желательно проверять посевы на присутствие в них психрофильных форм бактерий. Поэтому в этом случае делают два посева из одной пробы воды, один из которых инкубируют при 5⁰С, а второй - при 20⁰С.

О наличии роста в каждом из разведений пробы судят по общему помутнению содержимого пробирок, иногда сопровождаемому и изме­нением его цвета. Рост микроорганизмов обыч­но имеет место не во всех повторностях разведений, поэтому для расчета численности микроорганизмов в пробе обычно пользуются таблицами Мак-Креди (приложение 1), построенными на основе методов вариационной стати­стики.

Полученные результаты записать в тетради и сделать выводы.